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四种DNA纯化的方法及其原理介绍

来源:《实验手册》  作者: 裴黎  日期:2020-09-18

  DNA亲子鉴定实验操作步骤主要包括DNA提取、DNA纯化、PCR扩增(片段大量复制)、后PCR反应(片段长度标记)、毛细管测序仪检测(片段区分)、数据分析、出报告等。本文主要对DNA纯化的四种方法进行详细讲解。

  方法一、层析柱过滤纯化

  1、原理

  层析柱是商品化的试剂,它利用商品化树脂的作用,特异吸附DNA,然后经过洗脱与DNA分离,从而达到去除杂质,纯化DNA的目的。一般来说,利用树脂纯化的原理分两种:一种是利用疏水反应纯化核酸。另一种是利用混合离子交换及吸附反应进行纯化。

  在20世纪50年代,人们就已知道,在有离子液盐存在时DNA能与硅胶可逆结合。DNA双链与硅化材料相互作用的原理被认为是由于DNA分子中磷酸二酯链骨架在离子液盐作用下脱水,使得暴

  露的磷酸基团吸附硅胶。双链的DNA分子一旦被硅胶吸附,则以天然状态或部分变性状态(单链)存在,不能用洗脱RNA或碳水化合物等生物大分子的溶剂(如50%乙醇)将其洗脱下来。但是,经水溶性缓冲液(通常为TE或水)重新水化后,DNA就能从层析柱上定量回收。

  双链DNA与硅胶的吸附作用依赖于DNA的碱基组成和拓扑学结构。树脂本身的特点使其成为纯化环状质粒DNA及长链线状DNA片段的理想材料。但是,DNA与硅胶的相互作用还依赖于DNA的长度,小于100~200bp的DNA片段很难吸附到树脂上。鉴于上述原因,目前市场上的硅胶色谱纯化试剂不能用于小片段DNA的纯化。

  每个生产厂家都为其树脂配有详细说明书(表1)。因为质粒DNA与树脂的结合及洗脱依赖于树脂的结构和衍生化作用,所以使用时必须严格遵循生产厂家提供的说明书进行操作。

表1 常用树脂表

常用树脂表

  2、操作(以Promega公司WizardD? PCR Preps DNA Purification Systems为例)

  1.向100μl 直接PCR纯化缓冲液中加入PCR扩增产物(30 ~300μl) ,加入1ml Resin ,轻轻振荡混匀约3 ~5分钟。

  2.利用注射器,使混合液缓缓地通过纯化柱。

  3.向注射器内加人2ml 80%异丙醇,洗涤纯化柱内的DNA.

  4.将纯化柱置于1. 5ml离心管,上, 0000r/min离心2分钟。

  5.将纯化柱转移至一新的1.5ml离心管上,向纯化柱内加入30 ~50μl无菌水,静置1分钟。

  6.10000r/min离心20秒,弃掉纯化柱,-20℃储存备用。

  方法二、磁珠纯化

  1、原理

  磁珠是有磁性的能吸附DNA的物质,其内部核心是铁离子,在磁场作用下可以吸附在磁体上。在核心外,经过羧化,带有羧基基团,在特定的离子条件下,可以与DNA结合。结合后,在外磁场的作用下,磁珠与DNA结合体移动到磁体周围,可以很方便去除其他多余的液体,这时,不能与磁珠结合的所有杂质都随水溶液一并去除。

  然后,在洗脱条件下,DNA与磁珠分离,溶解在水中,将溶解有DNA的溶液转移,就得到了纯化后的DNA样本。

  2、操作

  取等体积的裂解液( Lysis buffer: DTT = 100:1)和DNA提取液放人1.5ml试管中;加入7ul磁珠,边加边在旋涡振荡器上反复快速振荡几次,让DNA分子与磁珠充分结合10分钟。充分混匀后放在磁分离架上,小心吸取废液,首先吸取上面的泡沫,吸液枪头切勿接近磁珠。

  如果DNA提取液较多,一次处理不完,可采用以下两种方式处理:(1)再取等体积的DNA提取液和裂解液重复上述步骤。(2) 提前将DNA提取液置MicoroconTM-100中在小台式离心机2500r/min(500g)离心10分钟留取上管的浓缩液,重复此步骤直到DNA提取液全部浓缩完,使最终DNA提取液控制在750ul以内。

  用100ul裂解液再洗一遍磁珠,在旋涡振荡器上振荡一下,1 ~2分钟即可放在磁珠架上吸出废液,注意:一定要把废液吸干净,先吸出泡沫防止磁珠随泡沫一起被吸走。加入100ul已配制好的洗液( Wash buffer:乙醇:异丙醇=2:1:1) ,在旋涡振荡器上振荡一下,振荡时间不宜过长,亦不宜太剧烈,点击振荡即可,把废液抽吸干净,重复洗三遍,然后室温下放置10分钟,让剩余废液挥发掉。向试管中加入20 ~40ul无菌水洗脱,盖好盖子在振荡器上振荡一下后放入65℃水浴箱中保温5分钟,同时也可以边水浴边振荡1~2次。从水浴箱取出试管立即放到旋涡振荡器上振荡,然后迅速放在磁珠架上,快速吸取含有DNA分子的洗脱液,于0.5ml试管中低温保存备用。

DNA纯化

  方法三、渗透液纯化

  1、原理

  利用渗透原理进行纯化是利用分子大小不同,小分子的物质能够通过渗透膜溶解到大量的溶液中去,而大分子的物质不能通过渗透膜,所以继续留存在透析袋中,通过沉淀最后达到去除小分子物质,得到纯化的有机大分子的效果。

  2、操作

  1.将溶于适量水中的DNA样本上样于15~20%丙烯酰胺凝胶制备胶上,按10V/cm条件电泳,过夜。

  2.电泳完毕后,取下凝胶于EB染色后观察;或直接将含DNA片段的凝胶置干硅胶荧光板上(CMC板)紫外线灯下,根据分子量的标准切下所需的区段(呈黑色)。

  3.将胶块置于少量缓冲液( 10mmol/L Tris-HCl, pH8.0,1mmol/LEDTA 300mmol/LNaCl),捣碎胶块,25~42℃浸泡过夜(4~24小时);或将胶块置于有少量缓冲液的透析袋中,通电下,寡核苷酸片段即进人透析袋中。洗脱的DNA片段以乙醇沉淀法沉淀、洗涤,真空抽干后溶解即可应用。

  浸泡的方法简单,成本低,易操作。利用电泳法分离速度较快,回收产率高。

  方法四、沉淀纯化

  DNA分子在高盐离子醇溶液中会被沉淀出来,而其他物质继续溶液在溶液中,沉淀出来的DNA分子经过离心与溶液成分分开,达到纯化的目的。

  1、乙醇沉淀纯化DNA

  1.在DNA溶液中加入0.2倍体积10mol/L醋酸胺溶液和2倍体积冷的无水乙醇。轻轻颠倒试管,直到彻底混匀。

  2.DNA在管中形成沉淀,可以用末端封口并拉制成U型的巴斯德移液管将DNA沉淀从乙醇溶液中移出。如果DNA沉淀成为碎片,离心5000r/min5分钟收集沉淀。

  3.用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次,离心5000r/min 5分钟收集沉淀。室温打开离心管挥发剩余乙醇,如果有真空泵,可以用仪器抽吸,至乙醇挥发,不宜采用加热等办法让DNA完全干燥,否则会造成DNA难以溶解。

  4.加入适量水或TE溶液溶解DNA,或使用振荡仪辅助溶解,储存DNA溶液于4℃备用。

  2、异丙醇沉淀纯化DNA(对于小体积和短片段DNA适用)

  在DNA溶液中加入9倍体积66. 7%异丙醇,保证体系中异丙醇的终浓度为60 +5%.轻轻振荡混匀,室温静置15分钟,12000 ~15000r/ min离心20分钟后,小心去除上清液。加入250μl 75%异丙醇,轻轻振荡混匀。12000 ~ 15000r/ min离心10分钟,小心去除上清液;加热使异丙醇挥发干净,加人溶液溶解备用。

  以上就是亲子鉴定中DNA提纯的常用方法,每种方法各有特点,应根据具体DNA片段来选择使用。

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