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DNA遗传分析仪核心技术与发展完善

来源:《科学技术》  作者: 李英  日期:2020-09-25

  本文通过梳理国产遗传分析仪的研制及其在实战中的改进升级历程,总结国产精密仪器研制和推广过程中的关键问题和瓶颈。

  一、DNA遗传分析仪的诞生及对我国的意义

  基于毛细管电泳技术的DNA遗传分析仪是当前DNA实验室的核心仪器,自1996年世界首台单通道毛细管电泳遗传分析仪ABI 310面世以来,已经从单通道4色荧光技术发展到24通道6色荧光,在法庭科学DNA鉴定领域获得了广泛应用并占有主导地位,我国DNA鉴定工作的开展长期依赖于国外仪器和试剂。

  为打破国外技术垄断,物证鉴定中心率先开展STR扩增试剂的研究并最终研制出DNATyper15TM扩增试剂盒,填补了国内空白。此后,第一研究所与物证鉴定中心联合承担了国家“十一五”科技支撑计划项目“DNA专用检测平台硬件关键技术研究”,2010年项目组成功研制出我国首台DNA遗传分析仪,命名为“GA118-16A型遗传分析仪”.

  GA118-16A型遗传分析仪的研制成功补齐了我国在DNA检测仪器方面的短板,掌握了从仪器、试剂到配套软件、耗材的全部核心技术并形成完整的产业链,彻底摆脱了对国外产品的依赖,是我国科学仪器领域取得的重大成就。

  我国DNA实验室多建在地市级,面对各区县送检的大量接触DNA检材无法做到及时检验,而接触DNA检材对检验时限要求很高,超过两周后的检出率会明显降低,因此在案件高发的区县级建立DNA实验室非常有必要,可以有效缓解DNA检验不及时的问题。

  采用国外仪器试剂建立DNA实验室的建设成本、检测成本和后期使用维护成本昂贵,普通区县级难以承担,GA118-16A型遗传分析仪价格不到国外仪器的一半,技术指标达到了国外仪器同等技术水平,完全实现了国产化替代,自推广应用以来,已在全国130多家DNA实验室进行实际案件的检验,取得了显着的社会效益和经济效益。

  二、核心技术及同类比对

  (一)核心技术

  GA118-16A型遗传分析仪工作原理如图1所示,充满凝胶的16通道毛细管阵列置于恒温环境中,通过电进样方式将扩增后携带荧光染料、大小不同的DNA片段吸入毛细管,在高压电场中进行电泳,依靠凝胶的筛分能力将大小不同的DNA片段分离,荧光染料在毛细管检测窗口处被激光激发,经过准直滤光、光栅分光、会聚成像到CCD上,数据采集软件采集电泳过程中的各项参数及CCD信号形成原始数据文件,再经过二级数据分析软件进行结果分析。

GA118- 16A遗传分析仪工作原理

  GA118-16A型遗传分析仪是结合我国DNA实际检测需求专门研制,采用16通道毛细管阵列,支持多达6色荧光数据采集,可实现24小时无人值守自动化运行,主要包括如下核心技术:

  1. 正交激发

  通过一系列反射镜、半反半透镜、波片、会聚透镜等光学器件将一束激光分为能量均衡的上下两路,聚焦到内径50μm的16根毛细管阵列进行荧光激发,保证16根毛细管得到峰形尖锐、峰高一致的拉曼峰;

  2. 微弱荧光采集

  通过长波通截止滤光片、大相对孔径消光差光学镜头、反射式光栅、制冷CCD组成的分光系统对激发的微弱荧光信号进行采集,得到高信噪比的电信号;

  3. 精密温度控制

  对两片半导体制冷片进行快速升降温控制使电泳过程中恒温箱内部的温度均匀性<1℃,温度稳定性<0.2℃;

  4. 嵌入式测控系统

  采用多处理器嵌入式控制系统实现对自动进样器、注胶泵、恒温箱、激光器、高压电源、CCD荧光采集系统等部件的实时监控,与数据采集软件进行通讯并接受上位机管理,完成仪器开机自检、空间校正、光谱校正及样品电泳等功能;

  5. 数据采集及处理算法

  实现对CCD荧光数据的实时采集并对原始数据进行滤波、去基线、峰识别、光谱解耦等核心算法处理,结合检测样本STR数据采集过程中的样本信息、用户信息、运行参数、染料集、空间校正、光谱校正等信息生成原始数据文件并保存到本地数据库。

  (二)同类比对

  GA118-16A型遗传分析仪与国外同类产品相比,主要有以下两方面的区别:

  (1)GA118-16A采用氩离子气体激光器,激发波长为488/514.5nm,国外同类仪器采用固体激光器,激发波长为505nm,二者的最大输出功率均为25m W,在激发效率上无明显差别,固体激光器体积更小、功耗更低、寿命更长;

  (2)检测通量不同,GA118-16A采用16道毛细管阵列,单次运行可检测16个样本,国外仪器有8通道和24通道两种通量,其余技术指标如检测时间、分辨力、最大读长、染料数量、检测灵敏度等均与国外仪器相同。

  GA118-16A型遗传分析仪的优势在于性价比高,能够满足经费不充足的区县级单位的实际需求,同时采用全中文操作软件并对界面进行了优化设计,简单易学,特别适合新建DNA实验室人员使用。

  三、发展与完善

  DNA遗传分析仪涵盖光、机、电、液、生化、算法等诸多前沿学科技术,具有极高的技术壁垒,需要长期的磨合改进才能获得仪器的高度稳定性和可靠性。GA118-16A遗传分析仪自研制成功之日起,一直通过实际应用接受测试与检验:

  在性能指标方面,对仪器进行了法医学有效性验证,测试了恒温箱温度的稳定性、内标定长误差、分型结果的准确性及对不同检材的适应性;

  在与进口仪器的比较方面,应用案件中的血液、脱落细胞、唾液及混合样本与进口仪器进行平行比对分析,验证了GA118-16A对于不同检材的分析能力,并提出了增加6色荧光分析能力的应用需求;

  通过在高海拔地区213起案件的检验,验证了仪器在高海拔复杂环境下的可靠性和稳定性。

  在大量应用测试的基础上,第一研究所对GA118-16A型遗传分析仪不断改进与完善,最新研制成功的GA118-24B型遗传分析仪,在零部件改进、整机性能指标提升、仪器可靠性和稳定性的增强等方面均取得了明显突破,进一步提升了国产遗传分析仪的技术水平。

  (一)零部件改进

  GA118-24B型遗传分析仪在16A型的基础上,对多个零部件进行了改进与优化:

  (1)采用单波长505nm固体激光器,与16A型的氩离子气体激光器相比,在功耗、噪声、功率及寿命等方面得到了显着提升,如表1所示,其输出的最大功率增加到50m W,是国外同类仪器最大输出功率的2倍,为更大范围的STR片段分析和测序应用奠定了基础;

  (2)优化了恒温箱的设计,24B型恒温箱半导体制冷片数量由16A型的2片增加到了4片,同时改进了温度控制算法,优化了内部空气对流循环设计,将升温时间(从室温到60℃)从20min缩减为15min,内部温度的均匀性与稳定性得到进一步提升,充分保证了每根毛细管电泳时温度的一致性和更好的数据质量;

  (3)取消了16A型的机械光闸,改用电子光闸作为数据采集时的激光快门,仪器运行时噪声明显降低,电子光闸的寿命和故障率要远远优于机械光闸;

  (4)采用了创新的光纤分光技术,避免了传统光学系统中大量反射镜、半反半透镜、汇聚透镜等的使用,在提升传递效率和激发效率的同时,减少了因镜片灰尘和水汽凝结带来的效率降低和频繁的系统维护,同时使光学系统的稳定性和可靠性得到明显提升;

  (5)采用了更大面积的CCD图像传感器,图像面积为12.288mm(H)×12.288mm(V),512×512像素,与国外同类产品相比面积增加一倍,不仅具有较高的灵敏度和较宽的光谱采集范围,同时可在荧光染料通道数量上进一步拓展,具备了8色甚至9色荧光信号采集能力。

固体激光器与气体激光器的技术参数

  (二)整机性能指标提升

  通过上述零部件的改进,GA118-24B型遗传分析仪的性能指标得到明显提升:

  (1)由于采用了更大面积的CCD,检测通量由16道毛细管阵列升级为24道毛细管阵列,如图2所示,单次运行可同时分析24个样品,在片段长度≤500bp时平均运行时间35min,24小时检测通量不低于936个样品,可满足各种DNA实验室需求;

  (2)整机体积更小,噪音、功耗更低,如上所述固体激光器相对于气体激光器体积更小且无需风冷散热,功耗更低,24B型遗传分析仪整机功耗由16A型的1500W降为500W且噪声水平明显降低;

  (3)检测速度更快,由于恒温箱升温速度的提升,仪器单次运行时间由45min减少为35min,提升了DNA鉴定的工作效率;

  (4)支持更多染料通道的荧光数据采集,大面积CCD图像传感器使得GA118-24B遗传分析仪具备了高于当前国外仪器6色荧光数据采集的能力,目前已初步实现了8色荧光数据的采集和分析且可向更高的9色荧光、10色荧光采集拓展。

GA118- -24B型遗传分析仪空间校正

  (三)可靠性和稳定性的增强

  GA118-24B遗传分析仪完善了对电泳过程中各项参数如电泳电压、电流、激光器功率、CCD温度、注胶泵压力等的全过程实时监控,提高了仪器的故障处理能力和长期运行的可靠性:

  (1)增加了电泳前的电流检测功能,通过预加电压得到的电流值判断电泳回路有无气泡,降低了因用户未观察到气泡存在而导致的电泳失败故障率;

  (2)采用固体激光器和光纤分光技术,如图3所示,在减小整机体积的同时,GA118-24B遗传分析仪光学系统的可靠性和稳定性得到极大提升,能够适应更为恶劣的工作环境,可进一步应用到车载移动DNA实验室,提升DNA检验的灵活性和机动性。

24B采用光纤分光激发系统

  四、未来发展趋势

  历经十几年的发展,国产DNA遗传分析仪已在全国130多家DNA实验室进行实战应用并陆续出口到阿根廷、安哥拉、莫桑比克等多个国家,形成了GA118-16A、16B、24B等型号产品,产品的主要技术指标如检测通量、分辨率、检测灵敏度等均达到国外产品同等技术水平,核心部件实现国产化,大幅度降低了使用维修成本,为我国DNA数据库建设和DNA检测技术的普及应用打下了坚实基础。

  NGS新一代测序技术已经开始在DNA检验领域初步应用,在降解样本、复杂混合样本分析等方面具有一定的优势,但检测成本昂贵、数据处理复杂、与现有DNA数据库难以兼容等因素仍是制约其在法医学领域普及应用的关键,NGS新一代测序技术可以作为现有毛细管电泳技术的补充和完善,短时期内难以实现完全替代,且面临三代单分子测序技术的挑战,二者在科研、医疗领域已经开始初步应用,在DNA分析领域,毛细管电泳遗传分析仪仍会在未来很长一段时期占据主流地位,并会伴随新材料、新技术的出现和应用快速发展,主要发展方向有以下几个方面:

  (一)仪器性能方面的继续提升

  为进一步提高检测通量,第一研究所在研的48通道、96通道遗传分析仪,利用现有24通道仪器平台,重新设计荧光激发系统和荧光光谱采集系统、恒温箱控制系统、数据采集软件和进样系统,实现更高通量的毛细管电泳检测;在荧光光谱通道数量上进一步拓展,开发基于8色及以上STR扩增试剂盒的光谱校正和数据处理算法,实现更多荧光通道的数据采集分析;

  在检测速度上进一步提升,影响现有仪器检测速度的是恒温箱的升温速度,采用半导体制冷片加热从室温升到60℃大约需要20min,约占整个检测时间的一半左右,采用最新柔性电加热器件如碳纤维、石墨烯等,可以将恒温箱升温时间减少到2min以内,整个检测时间可从35min减少到20min.

  (二)自动化水平的提升

  目前遗传分析仪生成的原始数据必须通过二级分析软件进行分析,需要人工干预并处理,未来的发展方向是整合数据采集软件与分析软件于一体,结合人工智能技术自动完成数据分析,在上样前设定分析参数后自动分析结果,仅需人工最后审核即可。

  同时随着实验室管理系统(LIMS)的快速发展,需要开发相应的系统接口模块将遗传分析仪接入LIMS,主要实现样品表单导入、运行状态监控、分析结果上传、任务管理、用户管理、质控管理等功能,LIMS系统可通过相应的模块查看检测任务、掌握任务执行情况、跟踪样品检测进度、查看检测结果、对样品进行全过程监控,同时记录实验过程数据以便进行问题溯源,提升实验室人员的工作质量和效率以及实验室的管理水平。

  (三)一体化DNA快速检验设备

  整合DNA检验的提取、扩增、检测环节于一体,结合微流控芯片加工技术,研制一体化DNA快速检验设备。目前仅有美国Integen X公司的Rapid HIT 200(8通道)和美国ANDE公司的DNAScan(6通道)两款商业化产品,上述产品与传统毛细管电泳仪相比,存在检测成本高、通量低等缺点,难以进行大范围推广应用。

  第一研究所自主研发了固体激光器结合光纤分光和微流控芯片加工技术,为国产DNA快速检验设备突破技术瓶颈,研制出高通量低成本的DNA快检设备提速。DNA快速检验设备对人员、环境等要求较低,在紧急重特大事故处理和快速检测方面应用前景广泛,在研的国产快检设备用时短、速度快、成本低,将进一步降低DNA检测技术门槛,使DNA检测技术在更大范围内得到普及应用。

  (四)车载移动DNA实验室

  国产仪器以固体激光器和分光光纤作为荧光激发和激光传输的核心部件,能够有效避免传统光学系统因震动造成的光路偏移,通过在高原地区进行国产核酸提取仪、扩增仪及遗传分析仪的200千米车载移动实验,验证了采用国产设备设计车载DNA实验室的可行性。

  五、结语

  近年来我国高度重视精密仪器的创新发展,鼓励核心仪器装备的自主研发,面对起步晚、理论创新不足、核心零部件受制于人等困难,国产DNA遗传分析仪经过十几年的持续发展,突破了种种困难,打破多项技术垄断和封锁,研发形成了诸如光纤传输、反射式光栅分光、荧光光谱预处理算法、嵌入式测控系统等核心技术,累计获得40余项专利,保证了关键核心技术的自主可控,完成了从跟跑到并跑的质变,走出了一条产、学、研、用紧密结合的自主创新之路。

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