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用于DNA甲基化检测的常见传统方法

来源:《标记免疫分析与临床》  作者: 杨林林  日期:2020-07-22

  近年来发展了很多 DNA 甲基化的检测技术,目前依据对样本DNA 的预处理方法,可以将DNA甲基化检测的手段分为三大类:①基于限制性酶切预处理;②基于亚硫酸氢盐处理;③基于亲和富集预处理。

  在限制性酶切预处理为基础的甲基化检测技术中,首先是通过限制性内切酶HpaII处理来检测DNA甲基化,保护甲基化CpG位点,而未甲基化CpG被酶消化。后来,WAALWIJK等发现了HpaII的同分异构体MspI,以在与HpaII相同的位置上裂解DNA,而与它们的甲基化状态无关。酶处理可以在小试管中进行,非常简单。进而许多方法已经开发了使用MsPI和HpaII酶,以精确地量化DNA甲基化在某段区域和全组的水平。但是,酶处理只能识别CpG位点(CCGG)之前的胞嘧啶,因此不能完全准确地显示基因组中甲基化情况的全貌。

  FROMMER等发现的亚硫酸氢盐测序是DNA甲基化研究中的里程碑。亚硫酸氢盐处理DNA可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。因此,与未甲基化的DNA相比,它在甲基化的DNA中产生了不同的碱基组成,可以很容易地使用常规测序技术对其进行定量分析。因此,已根据这一概念发展出了很多甲基化检测的方法。

  亲和富集方法是基于使用甲基结合蛋白从基因组DNA中分离出CpG岛。使用HpaII酶切来确认分离区域的甲基化状态,序列通过Southern blotting或基于微阵列分析得到。WEBER等开发了甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP),设计了对5-甲基胞嘧啶具有特异性的抗体,从片段化的DNA中分离出甲基化区域来进行微阵列技术分析。然而,该抗体只有在DNA是单链的情况下才能捕获甲基胞嘧啶。因此,RAUCH等开发了Methylated CpG island recovery assay (MIRA),使用的MBD2b蛋白,其在所有已知的甲基化CpG结合蛋白中对甲基化CpG二核苷酸的亲和力最高。MIRA与MeDIP的区别是MIRA可以识别双链DNA中的CpG甲基化,进而可以用于分析高通量DNA甲基化的检测。虽然亲和富集方法适用于高通量分析,但耗时、昂贵的仪器和数据分析是临床应用的挑战。

甲基化检测

  基于亚硫酸氢盐的处理来进行DNA甲基化检测与分析的方法目前仍是主流,常用的有MSP、MethyLight、digital MSP、核酸质谱、甲基化芯片、亚硫酸氢盐一代测序和二代测序这几种方法。以及后来新技术-三代测序的发展与应用,摆脱了繁杂的亚硫酸氢盐处理的过程和PCR扩增程序,大大降低了实验的偏差。下面将对这些方法展开综述。

  1、Methylation- Specific PCR(MSP)

  在甲基化特异性PCR(MSP)提供了CpG岛整体甲基化状态的评估,包括一些定量分析。WANG等开发了甲基化特异性PCR (methylation- specific PCR, MSP),对抽提的DNA进行亚硫酸氢盐的转化,未甲基化的的胞嘧啶转变为尿嘧啶,随后设计两对甲基化特异性的引物和非甲基化特异性引物来区分甲基化和未甲基化的DNA.也可以区分未修饰的DNA或反应不完全的DNA,因为这些DNA之间存在明显的序列差异。该方法对CpG岛中几乎所有的CpG位点的甲基化都是敏感和特异的。FOX等利用MSP设计引物去选择性地放大受体酪氨酸激酶EphB6的启动子的甲基化区域,从而有助于识别正常、非侵入性和侵入性乳腺细胞,进而讨论了EphB6作为诊断和预后指标的潜在意义。HERMAN等使用MSP方法,成功地检测了人类肿瘤组织中四个抑癌基因的异常甲基化,始终可以检测到0.1%的甲基化DNA(50pg)存在于其他未甲基化的样本中,具有较高的灵敏度。

  ZHANG等建立了一种多重MSP检测方法,通过鉴定无细胞血清DNA中甲基化频率较高的基因(APC、RASSF1A、CDH1、RUNX3、TFPI2、SFRP5和OPCML)来构建多重MSP检测,形成了卵巢癌早期检测的合适和可靠的方法。此外,在MSP中,同时检测单个样本中的未甲基化和甲基化产物证实了DNA作为PCR模板的完整性,并允许对等位基因类型进行半定量评估,但需要较多样本量。

  2、MethyLight

  MethyLight同样也是以亚硫酸氢盐的转化为基础,需要的DNA的量很少,因此可以检测从石蜡包埋的组织样本中获得的DNA.EADS等在MSP的基础上开发了MethyLight法,克服了MSP无法进行准确定量的限制,将探针荧光基团使用实时荧光PCR读出,通过测定Ct值来对DNA甲基化进行定量,并提供定量的高通量甲基化检测,其灵敏度可从10 000倍的未甲基化DNA中检测出甲基化DNA.

  HE等使用多重MethyLight聚合酶链反应(PCR)检测检测外周血中ALX4、SEPT9和TMEFF2的甲基化状态来作为检测结直肠癌的生物标志物的联合研究,进行了结直肠癌无创早期的筛查研究。DISTLER设计的Heavy- Methyl方法也使用荧光探针来量化甲基化状态,在其试验中使用甲基化特异性阻滞剂,优先阻断未甲基化DNA的扩增。Heavy- Methyl方法对检测500倍未甲基化DNA的甲基化也很敏感。MethyLight和HeavyMethyl均已被用于GSTP1和SEPT9特异性高甲基化检测前列腺癌和结肠直肠癌。MethyLight的另一个版本包括WOJDACZ等开发的甲基化敏感性高分辨率熔解(MS- HRM),甲基化扩增子和未甲基化扩增子都用PCR扩增两者DNA的熔化曲线有显着差异。因此,通过比较熔融图谱和标准图谱来估计未知DNA扩增子的甲基化水平。MethyLight是一种高度灵敏的活体分析方法,能够检测甲基化的等位基因,可以快速筛选成千上百种样品,不需要进一步的电泳分离和杂交。并且MethyLight还可以通过使用多个荧光标记探针进行复用,因此非常适合高通量应用。

  3、Digital methylation- specific PCR(Digital MSP)

  在一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后,随之发展的数字PCR(digital PCR)技术是第三代PCR技术。数字PCR是一种不需要标准曲线的核酸绝对定量的终点方法,可以对液滴进行约20 000或更多的分割,将样本随机分配到不同的腔室来实现的,以确保有些腔室有一个或没有核酸。通过热循环和读取后,最后根据泊松分布来进行绝对定量。

  将数字PCR应用于DNA的甲基化检测,可以大大提高检测的灵敏度和特异性并实现绝对定量。LUO等在研究中使用了MethyLight液滴数字PCR(MethyLight ddPCR),并将其性能与广泛使用的传统MethyLight PCR进行了比较。其研究分析证明了MethyLight ddPCR的敏感性是传统MethyLight PCR的25倍,能够检测甲基化水平在低至0.032%混合样品中的NTRK3.在评估结直肠癌组织样本中EVL的甲基化水平时,MethyLight ddPCR将变异系数相比于常规MethyLight PCR降低了6%~65%.并且,MethyLight ddPCR具有在正常结肠黏膜样本中检测罕见甲基化EVL等位基因的能力,而这是常规MethyLight PCR检测不到的。SARTORE- BIANCHI等在转移性结直肠癌中使用替莫唑胺或达卡巴嗪进行了5项临床试验,由于MSP的检测结果一般,而改变检测手段选用免疫组化和数字PCR进而提高了实验结果的阳性率。数字PCR的出现有效弥补了第二代PCR系统灵敏度低、重复性差、无法进行绝对定量等缺点,在癌症研究领域潜力巨大。利用数字PCR技术还可以富集标本中的待测靶基因,用于二代测序辅助建库、文库质控和测序结果验证等。

测序仪

  4、核酸质谱

  EHRICH等开发了EpiTYPER,在其研究中介绍了一种利用碱基特异性核酸裂解亚硫酸氢盐转化的DNA进行甲基化分析的质谱方法。使用位于CpG岛外和带有T7启动子序列的引物进行PCR扩增,PCR产物被转录成RNA转录本然后被特异性地裂解碱基。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI- TOF)质谱分析裂解产物,得到了一个特征质量信号图。甲基化与非甲基化的DNA,其质量位移不同,从而确定模板序列中哪些CpGs被甲基化。该方法可在不克隆PCR产物的情况下对混合物进行分析。质谱分析法可以适应各种需求的DNA甲基化分析,包括发现在大的基因组DNA甲基化与单个卵裂反应,分数至少5%甲基化DNA可以在混合物中发现, 传统的高通量MALDI- TOF质谱仪每天能够处理6 000个样品,允许甲基化位点的高通量识别和在单个或多个CpG位点的定量测量。

  ALLEGUE等利用Sequenom mass array TMMS质谱系统分析了欧洲的502个样本中KCNQ1、KCNH2和SCN5A的433个突变,实现了半自动化的MALDI- TOF系统,能够对样品进行有效的突变和遗传多态性检测,可以快速、有效地在尸检不出任何结论的情况下,明确死因。FREIRE- ARADAS等利用EpiTYPER技术进行了甲基化的检测,作为基因组局部区域的发现工具,用于对甲基化CpG位点的筛选并最终建立关于年龄预测的面板,将其用于法医年龄估计研究中。

  5、甲基化芯片技术

  甲基化芯片同样是基于亚硫酸盐处理或是酶处理后的DNA序列杂交的信号探测,最后进行芯片杂交,通过计算甲基化和非甲基化位点的荧光信号比例,可确定某位点的甲基化水平。甲基化芯片能够直接对任意物种的高甲基化片段进行检测,无需已知的基因组序列信息,检测范围可以覆盖整个基因组的甲基化区域。

  HONG等利用集成微流控芯片对预富集DNA进行电化学检测,通过在芯片上进行连续的电化学传感来测量人体尿液样本的甲基化水平,能够在50 pmol/L到500 nmol/L的浓度变化范围内检测到10%到100%范围内的甲基化水平。WU等通过基于微流控芯片的数字PCR定量测定DNA甲基化水平,检测下限为0.52%.用传统的焦磷酸测序对这些样品进行对比分析,与芯片结果一致,表明了该技术高灵敏度和低成本的优点,为DNA甲基化检测和表观遗传学相关疾病的早期诊断提供了新的选择。

  6、测序技术(亚硫酸氢盐一代测序、二代测序、三代测序)

  测序技术在基因组的研究不断应用,从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法),发展至今三十多年时间,测序技术已取得了相当大的发展,测序读长从长到短,再从短到长。目前测定DNA甲基化最可靠和最流行的方法之一是亚硫酸氢盐测序,该方法结合了亚硫酸氢盐转化DNA分子和高通量测序,测量单核苷酸分辨率下的DNA甲基化。进行全基因组亚硫酸氢盐测序,首先将基因组DNA随机片段化到所需的大小(200 bp)。通过连接到适配器将DNA片段转换成一个测序文库,用亚硫酸氢盐处理文库再进行PCR扩增,然后进行高通量测序,它通常能在无偏表达的情况下覆盖人类基因组中90%以上的CpG.

  REED等对亚硫酸盐测序和焦磷酸测序进行对比评估,通过实验来检测和量化各种药物敏感和耐药的MCF- 7乳腺癌细胞系中ABCB1启动子的低甲基化、高甲基化和混合甲基化。发现尽管这两种方法都能可靠地检测DNA的甲基化增加、减少和混合,而亚硫酸氢盐测序在检测DNA的强甲基化时比焦磷酸测序更敏感。他们用14例健康人外周血基因组DNA,对12个基因座中465个CpG位点的DNA甲基化进行靶向下一代亚磷酸氢盐测序分析。发现二代亚硫酸氢盐测序是一种快速、可靠的单碱基分辨率的DNA甲基化定量数据,同时能够很好地覆盖多个基因座和多个样本中分析的CpG位点。FRIMER等利用二代测序确定宫颈上皮内瘤变3(CIN3)和HPV16 CpG甲基化和甲基化单倍型之间的关系。预测CIN3的敏感性为98%,特异性为62%,表明了二代测序测序是评价HPV16甲基化状态的一种有前途的方法,揭示了甲基化单倍型分析的价值。

  然而,经过亚硫酸氢盐处理的这些区域的短链读取通常不能唯一地映射到它们的原始位置;相反,它们很可能与多个位置含糊地对齐。而三代测序技术可以达到长1Mb的序列长度,且对GC含量高的区域能够进行更加准确地测序,省去了亚硫酸氢盐处理的步骤。在三代测序中,常见的是SMRT测序(SMRT sequencing)和纳米孔测序(nanopore sequencing)。SMRT测序使用把发夹适配器连接到目标dsDNA分子的两端而形成的封闭的圆形ssDNA模板(SMRTbell)。聚合酶- 引物- SMRTbell复合物通过生物素- 链霉亲和素化学作用与纳米级的观察室底部结合。复合物中的聚合酶含荧光因而可以记录荧光的颜色和核苷酸的合并时间[脉冲间隔时间(IPD)].表观遗传修饰的存在会导致IPD延迟。纳米孔测序是利用膜上的纳米孔来对单链DNA或RNA分子进行测序,在流动细胞中两个离子溶液充满的隔间被一层含有纳米孔的膜隔开。恒偏压通过纳米孔产生离子流,在DNA或RNA分子移位时,可以观察到离子流的变化并加以表征。纳米孔中的电流是传感器来测量并以图形表示。

  EUSKIRCHEN等探讨了一个口袋大小的纳米孔测序装置的潜力,纳米孔测序在6h内获得了约0.1%的基因组覆盖率,得到的拷贝数和表观遗传图谱与匹配的微阵列数据具有良好的相关性而且成本很低。在诊断时间和所需的实验室设备和专业知识方面,它优于基于杂交和当前的测序技术。ICHIKAWA等报告了一个通过单分子实时(SMRT)测序的经济甲壳类物种泥蟹的完整长读转录组。结合二代测序,进一步分析和验证不同性腺分化状态性别间的差异表达基因。证明SMRT长读转录组的质量包括序列的N50、注释率、物种命中率等明显高于之前组装的转录组。FLUSBERG等通过单分子实时测序(SMRT)直接检测DNA甲基化,不同的修饰对聚合酶动力学的影响是不同的,因此可以进行区分,在高度重复的基因组区域中实现甲基化模式的映射。

  第一代测序技术具有高达99.999%的准确性,测序读长也可以达到1 000 bp,但是其测序成本高、通量低、步骤繁多,使其大规模的真实应用受到限制。第二代测序技术不仅大幅提高了测序速度,还大大地降低了测序成本,并且保持了高准确性,但是二代测序读取的序列短,其对GC含量高的区域不能进行正确表征。三代测序技术读取的序列长度增加,最显着的特征是单分子测序和实时测序,每个碱基掺入后,测序暂停。尤其对GC含量较高的区域的准确测序弥补了二代测序的不足。

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