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分子诊断中实时聚合酶链反应技术探析

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-07-29

  1、原理

  实时PCR(real time PCR)也称实时荧光PCR.是指利用荧光染料或荧光探针,在PCR过程中实时监测荧光的变化,获得PCR动力学曲线。借以实现对扩增模板的定性和定量分析。简单地说,实时PCR就是PCR的在线分析技术。此外,不少研究者也将那些在实时PCR仪器上实现的技术笼统称为实时PCR技术。

  例如,在遗传病领域应用较多的探针熔解曲线分析和高分辨熔解曲线分析,虽然实质上都属于终点检测模式,但由于它们的检测化学源于实时PCR,且又在实时PCR仪器上实现。很多情况下也习惯地被称为实时PCR技术(图1)。

  为区别起见,我们遵守实时PCR的公认定义,将上述采用终点检测模式的技术归为实时PCR相关技术。实时PCR的检测化学有多种形式,总体上可分为荧光嵌入染料型和荧光探针型两种。荧光嵌入染料型是利用双链DNA嵌合染料(如溴化乙锭、SYBR Green 1、LC Green和SYTO9等) 来指示扩增产物的变化。

  由于荧光染料可以嵌合所有双链DNA发出荧光,因此具有通用性,但由于无法区分特异扩增产物和非特异扩增产物(如引物二聚体) ,特异性较低。荧光探针型是利用与靶序列特异杂交的荧光探针来指示PCR产物的变化,探针设计只与目标扩增产物杂交,因此特异性较高。

  探针类型主要有TaqMan探针、分子信标、相邻杂交探针、双链置换探针等。这些探针基本上都是利用荧光共振能量转移原理或者荧光淬灭原理,指示探针与靶序列杂交前后荧光强度的变化。荧光探针可通过标记不同的荧光基团,实现多种靶

  序列的同时检测。除以上两种检测化学以外,实时PCR还可以通过一些特殊设计的引物实现。

  与传统PCR相比,实时PCR具有以下优点:

  ①全封闭反应和检测,无须PCR后处理,大大减少了模板污染和假阳性的可能;
  ②特异性强。选择与靶序列特异性结合的荧光探针来检测产物,进一步提高了检测的特异性;
  ③采用对数期分析,摒弃终点分析法,可实现真正意义上的定量;
  ④仪器在线式实时监测,结果直观客观,避免人为判断,简便快速;
  ⑤使用96孔或384孔实时PCR仪可实现高通量检测;
  ⑥操作简单安全,自动化程度高。

  鉴于以上优点,实时PCR自1992 年Higuchi等16首次报道以来,在核酸检测尤其是分子诊断领域迅速取代传统PCR,成为新一代的分子检测“金标准”.

  2、应用

  相对于传染病以及肿瘤领域,实时PCR在遗传病领域的应用相对较少。在传染病和肿瘤疾病方面,检测对象相对简单,多是靶基因定量或者体细胞特定稀有突变检测。

  而遗传病的检测对象多为序列变异,种类繁多,检测难度高。以常见的单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)检测为例,就要求探针必须具备识别单个核苷酸变异的能力,这对于一个普通的20~30 bp的荧光探针而言,由于一个碱基的变化所引起的熔点变化很小,很难选择一个合适的温度,使探针仅仅与完全匹配的序列杂交而不与单个碱基不匹配的序列杂交,因此,经常需要特殊修饰的探针来增加探针的特异性,比如TaqMan-MGB探针、具有发夹结构的分子信标以及具有双链结构的置换探针等,但这些特殊的探针有的设计较为困难,且成本较高。

实时PCR的检测化学原理

图1 实时PCR的检测化学原理

  嵌合染料结合双链DNA发出荧光; TaqMan探针在引物延伸时被酶切后释放荧光;分子信标、置换探针和FRET探针均为退火杂交时发出荧光,其中FRET探针发出的荧光来自染料间荧光共振能量转移。

  另一方面,由于遗传病绝大多数都由多个基因位点的核酸变异引起,而实时PCR由于受仪器检测通道数目的限制,每个反应所能检测的变异位点数目十分有限。一般而言,一个四通道的实时PCR仪器可以允许单个反应使用四种不同荧光标记的探针,每个探针检测一个等位基因型,四种探针只能检测四个等位基因型,也就是两个变异位点,这就大大限制了实时PCR的应用范围。因此,到目前为止,在遗传病检测领域,实时PCR主要用于少数已知特定突变的检测,所涉及的疾病类型十分有限。

  3、实验流程

  3.1基因组DNA的提取

  实时PCR体系一般扩增片段长度在200bp以内,因此对于基因组DNA的降解并不敏感,而且动力学测定方式对杂质(抑制剂除外)也有一定的容忍度。因此,可用于实时PCR的基因组DNA来源并无特殊限制,全血、唾液、毛发、羊水、绒毛等均可;对提取方法也无固定要求,从经典的酚氯仿提取,到快速的离心柱式提取,再到日渐增多的磁珠式自动提取均适用。提取基因组DNA可以方便地用紫外分光光度计检测其质量和浓度,并用Tris-HCl(pH8.0)将DNA终浓度调节至10~ 100 ng/uL.

  3.2引物和探针的设计

  实时PCR一般要求片段小于200bp,并尽可能短以获得高的扩增效率,引物和探针的设计可根据NCBI上公布的基因序列,使用商业软件完成。对于检测单个碱基突变的探针,建议使用特异性高的分子信标和置换探针,而不是常规的TaqMan探针,因为后者特异性较低,也不建议使用成本很高的TaqMan-MGB探针。

  分子信标和置换探针容易设计,成本也较低,尤其是它们都可以利用合成的靶序列,通过探针/靶序列的杂交变温曲线验证探针的特异性,进而确定退火即检测温度。荧光标记染料的选择应参考所用仪器的规格。目前的实时PCR仪器一般都具有四个荧光通道,对应于FAM、HEX.ROX和Cy5四种荧光染料,它们也是目前用得最多的荧光探针标记染料。

  3.3实时PCR扩增与检测

  实时PCR扩增与检测同时进行,因此操作十分简单,只需将提取后的基因组DNA加入扩增体系即可,一般常见的扩增体系体积为25 μL,包括2.5 μL 10 X Buffer[160 mmol/L(NH,)2SO., 670 mmol/L Tris-HCl pH 8.8. 0.1% (w/v) Tween 20],1.5 μL 25 mmol/L MgCl,,每种dNTP 400 μmol/L, 每种引物0.4 pμmol/L, 每种探针0.1μmol/L,1.0UTaqDNA聚合酶,20ng模板DNA,具体组分可根据实际情况加以调整。

  实时PCR的程序按照仪器要求和反应条件进行设置,一个典型的反应条件为: 96℃ 预变性5 min,随后按照96℃变性15 s,55~65℃退火15 s,72℃延伸15s,扩增40~50个循环,并在退火时检测FAM、HEX、ROX和Cy5的荧光。在扩增完成后,即可根据各检测通道荧光信号的有无情况判断结果。对于点突变的检测而言,一般设计两种探针分别检测其对应突变的两个等位基因型,因此可以方便地根据两种荧光的有无,判断检测位点是野生型、突变型还是杂合型。

  4、常见问题及解决办法

  实时PCR用于突变检测时,常见问题多集中于探针的特异性和荧光信号的强弱上,分述如下。

  4.1探针的特 异性问题

  探针的特异性是实时PCR进行突变检测的保证,探针的特异性首先取决于探针设计,其次是反应条件。就探针设计而言,在使用商业软件设计时,一定要多用几种软件加以预测,我们特别推荐采用那些能够实际验证其特异性的探针,如分子信标和置换探针,而不是盲目地采用特殊化学修饰的探针或者特殊碱基修饰的TaqMan探针,以避免不必要的浪费。经过特异性验证的探针,其反应条件也较易获得,一般通过调整Mg2*浓度或改变退火温度即可。

  4.2荧光信号的强弱问题

  在探针质量保证的情况下,荧光信号的强弱取决于PCR的扩增效率和探针杂交效率两个因素。实时PCR因为存在探针对引物延伸的阻碍作用,扩增效率一般都低于普通PCR,因此实时PCR的扩增长度-般都在200bp之内。实际上影响PCR扩增效率的因素很多,引物的选择一般是首 先考虑的因素,建议上下游各合成数条,交叉比对选择其中较优者,通过实验进一步筛选。

  此外,PCR扩增体系成分以及扩增条件也都需要精心优化。所幸的是,对于遗传病检测而言,一般模板量充足,因此也不一定像检测细菌或病毒那样追求极限灵敏度而耗费大量精力进行优化。

  探针的杂交效率首先涉及模板本身,建议在设计探针时,一定要先对PCR产物中的探针互补链进行二级结构预测。遗憾的是,多数突变都位于二级结构丰富的区域,常常影响探针的杂交。为此,除了优化反应条件外,另一种办法就是引入非标记的探针帮助打开二级结构。

  对探针而言,除了按照其设计规则提高杂交效率外,还可通过调整探针的区域,以避开二级结构,或者添加能提高探针结合能力的修饰碱基(如LNA碱基),达到提高探针杂交效率和荧光信号的目的。

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