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高分辨熔解曲线分析基因分型检测技术

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-07-30

  1、原理

  高分辨熔解曲线(high-resolution melt curve,HRM)分析技术是一项新兴的突变扫描和基因分型检测技术。具备可同时识别多个突变位点、不受突变碱基位点与类型限制、无须昂贵的荧光探针等优点。如图1所示,HRM的主要原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性的不同,高分辨地识别熔解曲线的差异,进而对突变进行识别与分析。HRM对DNA序列的识别能力主要由三个因素决定:检测仪器的分辨率、双链DNA嵌入型染料的种类和PCR产物的纯度。

  DNA熔解曲线分析的概念于20世纪70年代提出。受当时实验条件的限制,科学工作者只能通过紫外吸收光谱来绘制熔解曲线。这种方法在检测精度上相比现在的研究手段大打折扣。随着仪器的改良和实时PCR技术的出现,人们开始用SYBR Green I荧光染料在定量PCR仪上监测熔解曲线的变化。SYBR Green I是一种不饱和荧光染料,不能保证全部PCR产物都嵌合上SYBRGreenI,其检测分辨率还是受到一定的限制。因此,SYBR Green I熔解曲线分析一般用于区分片段大小和GC含量差别显着的DNA序列,例如用于检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增,而无法区分单核苷酸多态性。

高分辨熔解曲线分析的原理

图1 高分辨熔解曲线分析的原理

  对杂合子而言,PCR完成后存在四种不同的双链:两种同源双链(黑色线条)和两种异源双链(点线条),后者稳定性较低,故熔点低于同源双链。杂合突变因为包含这四个品种,其熔解曲线(点划线条)实际上由这四个品种的曲线合并而成。

  饱和荧光染料和高分辨荧光PCR仪的开发使得熔解曲线分析技术能够精确识别DNA序列的细微差异,实现了真正的高分辨熔解曲线检测。高分辨熔解曲线与普通熔解曲线的一个显着差别是采用了饱和荧光染料。目前已开发的双链DNA饱和荧光染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9和Eva Green 等。

  这类染料比起SYBR Green I等非饱和荧光染料有着更强的DNA结合能力而且不会影响PCR扩增,同时在DNA解链过程中不会发生重排,使得用这些染料的熔解曲线有了更高的分辨率。运行高分辨熔解曲线需要具备相应的高分辨率实时荧光PCR仪。传统实时荧光PCR仪通常只能执行1℃/s精度的荧光监测,而新型高分辨率实时荧光PCR仪则可以执行0.02℃/s精度的荧光监测。

  高精度的温差控制与监测保证了高分辨率实时荧光PCR仪能够准确地表征出熔解曲线间的细微差异,从而实现突变的检测并区分纯合突变和杂合突变。另外,高分辨熔解曲线分析技术对PCR产物中的盐离子浓度很敏感,如果待检DNA样品带有杂质,有时易导致检测结果误判,因此在PCR扩增前应保证待检DNA样品的纯度。

  2、应用

  由于HRM分析不受碱基突变位点和种类的限制,因此能够应用于许多疾病诊断和突变检测。主要应用于突变扫描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。

  1.基因的突变扫描

  多数DNA序列的突变会导致熔解曲线熔点温度的细微差异,HRM技术具备高精度的熔解曲线区分能力,因此常用于基因突变的扫描。HRM技术进行基因突变扫描包括:样本中特定突变位点的筛查;疾病相关基因特定区段突变位点的扫描,新突变的发现;遗传性特定突变的筛查、未知突变的发现;动植物相关多态性位点的研究等。

  2.基因分型

  HRM能够在没有标记荧光探针的情况下,按照熔解曲线形状将绝大多数纯合子与杂合子辨别。杂合突变的熔解曲线会介于纯合野生和纯合突变样品的熔解曲线之间,因此其熔解曲线与纯合野生或纯合突变的熔解曲线间的差异非常细微。这就要求用于HRM基因分型的DNA样品及标准品必须具备很好的纯度。

  3.序列匹配

  在法医鉴定、组织移植、基因型和表型的区别中,对靶DNA进行序列匹配比基因分型更重要。根据熔解曲线结果的相似性,HRM技术能够快速确认造血干细胞移植前捐赠者和患者的HLA基因型亲缘关系并检测捐赠者的人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen, HLA)高度多态性位点类型。

  4.甲基化研究

  DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能异常,在细胞正常功能的维持、胚胎发育、遗传印记和肿瘤发生中扮演着重要角色。HRM根据解链温度差异可以反映同源片段之间的序列变化,已经用于甲基化检测。通过重亚硫酸盐处理DNA后,未甲基化的胞嘧啶转变为脲嘧啶,脲嘧啶经PCR扩增后变为胸腺嘧啶,使甲基化差别转换为碱基序列差别,通过HRM分析已知甲基化频率的标准品可以得到样品的甲基化频率。

DNA

  3、实验流程

  HRM的实验流程十分简单,只需在PCR扩增后,在具有HRM功能的荧光PCR仪器上运行一个HRM程序即可。由于HRM最重要的功能是基因突变扫描,且HRM各种应用的实验流程均大同小异,我们以人类甲基丙二酰辅酶A变位酶基因突变筛查为例,介绍HRM实验的基本流程。

  1.DNA 样品制备

  待检样品中的基因组DNA提取采用传统的苯酚氯仿抽提方法或现代的固相吸附洗脱提取方法均可。提取后的基因组DNA及标准品均需溶解于相同的缓冲液中,并通过测定紫外分光光度吸收值等方法保证样品提取后基因组DNA中携带的盐离子浓度的一致性。

  2.对照样品

  每次HRM分析待检样品时,均需同步检测野生型阳性对照样品,以便比较熔解曲线之间的差异。如果样品检测获得的熔解曲线与阳性对照样品一致则判定为野生型;反之,则判定为突变型。

  3.PCR 引物设计

  用于HRM分析的PCR产物最佳长度小于400 bp,大部分小于1 000 bp的PCR产物也可以进行分析。在HRM体系中,荧光染料也会嵌入非特异的PCR产物而产生检测信号。因此,在PCR引物设计时,对于特异性的要求高于一般实时PCR,应尽量避免形成引物二聚体。

  4.PCR扩增

  HRM分析的PCR体系中除了常规PCR组分外还需要添加LC Green等饱和荧光染料,同时为了减少引物二聚体的干扰,推荐采用热启动的Taq DNA聚合酶。

  以下为一例HRM分析的常用25 μL反应体系的PCR体系配方: 50 mmol/L Tris-HCI pH8.3,3.0 mmol/L MgCl2,2.5 mg/mL BSA,0.2 mmol/L dNTPs,2 U Taq HS,20 μmol/L.上游引物,20 μmol/L下游引物,3.0 μmol/L LC Green,5 μL基因组DNA或标准品模板。PCR扩增程序一般为: 95C预变性5 min,然后运行35~60个循环的95℃变性15 s,50~65℃退火20 s,72~76℃延伸25 s, 如有需要可以在退火步骤采集荧光信号以获取扩增曲线。在实际应用中可根据待检样品的不同需要对镁离子浓度、引物浓度及退火温度等条件进行调整与优化,以达到最佳的扩增效果。

  5.高分辨熔解曲线分析

  PCR产物可直接用于HRM分析,程序- -般为: 95℃变性2 min,55'C退火2 min,然后从50C按0.1~0.3C/s的速率逐步升温至95℃ ,并在每步升温时采集荧光信号。PCR产物可多次重复进行HRM分析。最后通过实时荧光PCR仪的软件比较待检样品与标准品间熔解曲线差异,进而识别待检样品的类型。

  4、常见问题及解决办法

  1.目的熔解曲线峰信号弱

  目的熔解曲线峰信号弱通常是由PCR产物不足造成的,可以通过优化PCR扩增条件来增加PCR产物量。

  2.熔解曲线中产生很强的引物二聚体峰

  引物二聚体峰的产生是因为PCR引物特异性不好,PCR引物间形成大量的引物二聚体,可以通过重新设计引物解决。

  3.在目的熔解曲线峰信号外出现杂峰

  非特异熔解曲线峰的出现主要是由于PCR引物特异性不好扩增出非目的PCR产物,可以通过重新设计引物解决。

  4.在目的熔解曲线峰信号外出现杂峰

  非特异熔解曲线峰的出现主要是由于PCR引物特异性不好扩增出非目的PCR产物,可以通过重新设计引物解决。

  5.野生型和突变型样品间的熔解曲线无法区分

  造成这一现象的原因主要有以下几种: PCR产物过长导致点突变无法带来足够的熔点温度差异,可以通过缩短扩增片段长度来解决;实时荧光PCR仪HRM程序设置不当,例如荧光采集的升温间隔过宽等,可以通过重新设置程序解决;野生型和突变型样品中盐离子浓度不均一导致熔解曲线的熔点温度偏移,可以通过重提标本解决。

  6.同类样品熔解曲线差异大

  造成这一现象的原因主要有以下两种: PCR体系在扩增过程中挥发损耗严重,导致HRM分析时各种组分浓度不一-致,可以通过添加矿物油等方法解决;样品中盐离子浓度不均一导致熔解曲线的熔点温度偏移,可以通过重提标本解决。

  7.不能识别颠换突变

  颠换突变造成的熔点温度差异很小,因此经常无法识别。目前HRM检测技术难以完全解决这--问题,可以通过在所有样品中添加一定量的野生型标准品一定程度上识别颠换突变。

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