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多重连接探针扩增技术介绍

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-07-31

  多重连接探针扩增技术( mutiplex ligation- dependent probe amplification, MLPA)主要用于较大片段基因组拷贝数改变的检测,例如基因外显子的缺失或重复、染色体非整倍体、染色体微缺失/微重复等,也可用于已知SNP或者单碱基突变的分析。近年来发展的甲基化特异性多重连接探针扩增技术( methylation-specific MLPA,MS-MLPA)和逆转录酶多重连接探针扩增技术( reverse transcriptase MLPA,RT-MLPA) .则分别用于DNA甲基化和mRNA相对定量分析。

  1、原理

  MLPA技术的特点在于其探针的设计。每个MLPA探针包括一段靶核苷酸特异性序列、一段填充序列和一段通用的引物序列(图1)。在MLPA反应中每一对探针与变性后的待测样本目标序列杂交,经过连接、通用引物扩增、毛细管电泳,在一管反应中实现约45个目标序列的分离。进而比较、分析目的序列的相对拷贝数。

MLPA的原理和实验流程

图1 MLPA的原理和实验流程

红色部分为探针中与靶序列互补的序列;黄色部分为通用引物序列;绿色部分为填充序列,每条探针该部分的序列长度不同,以便通过毛细管电泳进行区分。

  2、应用

  目前MLPA可用于多种单基因遗传病、染色体病、遗传性肿瘤和遗传药理学等临床检测项目。目前有200余种商品化试剂盒提供,详细目录可见https://www.mrcholland.com.

  1.基因外显子的缺失/重复检测

  MLPA是检测外显子缺失/重复的最佳方法之一。目前商品化的MLPA外显子检测试剂盒包含BRCA1、MSH2、MSH6、MLH1、DMD、APC、NF1、NF2、VHL、FBN1、RB1等近百个基因。

  2.染色体微缺失/微重复综合征(包括亚端粒缺失综合征)检测和诊断

  目前几乎所有已明确的染色体微缺失/微重复综合征都可以通过MLPA技术检测。如猫叫综合征(5p缺失)、无精子因子微缺失、Smith-Magenis综合征(17p11.2缺失)、1q21.1微缺失综合征、沃尔夫赫希霍恩综合征(4p16.3缺失)、迪格奥尔格综合征(22q11缺失)、Sotos综合征(5q35缺失或重复),以及亚端粒缺失的筛查和确认等。

  3.染色体非整倍体分析

  目前主要针对13.18、21.X和Y染色体的拷贝数进行分析,是- -种快速有效的染色体非整倍体快速诊断技术。由于不需要细胞培养、不需要活细胞、基因组DNA用量相对较小等特点,MLPA染色体拷贝数分析常用于染色体病的产前诊断。

  此外,MS-MLPA可用于拷贝数定量和甲基化特异性检测,RT-MLPA可用于mRNA表达检测。但是应用并不广泛,在此不做详述。

  3、技术特点

  相对其他拷贝数分析技术,MLPA成本低廉、操作简单、快速、通量高。可以检测Southern杂交和FISH技术检测不到的小片段重复或者缺失。

  4、注意事项

  MLPA的分析结果取决于待测样本与正常对照样本的相对比较,因此精确的分析结果要求待测样本和对照样本基因组的质/量以及实验操作流程尽量一致。

  MLPA用于小的缺失、插入或者已知SNP的检测时,探针设计原则有所不同。

  MLPA的技术原理决定了它主要用于检测较大片段的重复/缺失。在用于检测之前必须首先明白检测疾病的遗传特征、所购试剂盒的检测范围等,才能正确理解检测结果,形成准确描述的检测报告。

  比如,MLPA对于染色体非整倍体的检测快速高效,但是目前它仅用于分析13.18、21、X和Y染色体的相对拷贝数,不能发现这5对染色体的结构改变,不能检测低于一定比例的非整倍体嵌合体。又比如,MLPA对于脆性X综合征的辅助诊断仅局限于男性FMR1和AFF2基因启动子区甲基化分析,不能用于最常见的FMR1基因GCC片段重复次数异常的测定。

  MLPA技术具有高度的特异性和稳定性,其检测结果一般不需要进一步验证,但特殊情况或者非常见检测结果的判断仍需要谨慎。如MLPA技术用于产前诊断时,需要考忠胎儿组织母体细胞污染对结果的可能影响,对于男性胎儿性染色体异常、嵌合体胎儿、携带者胎儿的判断往往需要不同实验方法的确证。部分基因(如DMD)每个外显子仅设计有一对探针,此时如果出现单个外显子缺失,建议使用其他方法进行确证。

  5、MLPA-微阵列芯片技术

  MLPA技术虽然有许多优点,也在基因诊断中得到了广泛的应用。但是,该技术仍存在检测通量较低、灵敏度不高等弱点。针对这些问题,上海市儿童医院与荷兰Pamgene公司合作,将多重连接探针扩增(MLPA)与基因芯片微阵列技术结合,发展成二代基因芯片诊断技术,即MLPA-微阵列芯片技术(图2)。该技术将MLPA可以在同一试管内检测多种基因突变或一个基因中的多个位点突变的优点与微阵列芯片高通量的特点有机地结合起来,极大地提高了基因诊断的效率。

MLPA-微阵列芯片的原 理和实验流程

图2 MLPA-微阵列芯片的原 理和实验流程

红色部分为探针中与靶序列互补的序列;黄色部分为通用引物序列;彩色部分为填充序列,每条探针该部分的序列不同,但长度相同,该序列与芯片上特定位置的序列互补,因此可以将反应管中的反应液与芯片进行杂交,通过分析芯片中不同位置的荧光强度来对不同的检测位点进行分析。

  与传统的MLPA技术相比,MLPA-微阵列芯片技术具有以下优点:

  ①灵敏度高:由于应用的基因芯片呈三维结构,使反应面积扩大100倍,因此每次实验只需大约20 ng DNA或10 ng RNA即可,仅是Southern杂交或基因芯片分析所需的1/100~1/1000.
  ②特异性强:可检测基因序列中各单核苷酸的改变。
  ③操作简单:每一次基因诊断实验只需在同一试管内进行。
  ④信息量大:一个实验可同时检测超过100个位点的基因突变、缺失或重复(其中包含内参照,可以同时进行反应的质控监测)。
  ⑤成本低:由于点样在芯片上的是通用序列,因此该芯片可用于多种基因突变的检测,无须特殊的设计和生产,与以前的芯片相比成本大幅度降低。目前,一张MLPA-微阵列芯片的价格约为25欧元,可同时进行4个样品的基因分析,每一个病例基因诊断的成本或价格不比现有的基因诊断技术贵,甚至还要便宜。
  ⑥实用性强:可以检测点突变、片段微小缺失、重复等异常,不仅可对遗传病,而且对,肿瘤等其他疾病可做早期基因诊断,具有很广阔的应用前景。

  正因为MLPA-微阵列芯片技术具有以上优点,从而将基因诊断的水平提高到一个新的高度,克服了目前基因芯片技术在基因诊断中的局限性,非常适宜广泛应用于临床上的诊断。

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