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Sanger测序法的原理、流程及应用

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-07-31

  Sanger测序法又名双脱氧链终止法,由英国着名生物化学家Frederick Sanger等于1977年发明,一经问世便轰动世界。Sanger 更是凭借此技术获得1980年诺贝尔化学奖。在此之后长达30年的时间里,Sanger测序法作为第一代测序技术的标志被广泛应用,一直统治着DNA测序行业。随着时间的推移, Sanger测序法的硬件进一步完善,流程更趋于自动化,例如:同位素标记法被荧光标记法取代,可以被照相机和计算机系统自动识别;凝胶电泳的形式升级为毛细管电泳,将DNA测序限制在一条条封闭的毛细管里,避免了相互间的干扰。

  1、原理

  在DNA聚合酶DNA引物、4种单脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)共存的环境中,核酸模板(单链/双链)可以复制。在此基础上,将其分成4个独立的测序反应体系,分别按比例引入4种荧光标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。ddNTP是Sanger测序法的核心,较dNTP缺少一个形成磷酸二酯键所必需的3'-OH,导致在DNA的合成过程中,由于ddNTP的插入使得核酸链无法形成新的磷酸二酯键而终止延伸,最终产生不同长度的核酸片段,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据条带大小可将其分开。

  如此,每个反应体系中以相同的引物为5端开始延伸,以各自的双脱氧碱基为3'端终止而形成一系列长度各异的核酸片段,其长度取决于引物末端到核酸链异常终止位点间的距离,4组分别含有不同ddNTP的反应体系最后将得到终止于模板链每一个A、C、T、G位点上的4组寡核苷酸。反应完成后,分4个泳道进行凝胶电泳,分别对应A、C、G、T四种碱基,电泳后可将相差只有一个碱基的核酸片段分开。通过明确不同片段的3'端双脱氧碱基,便可依次读取新合成的核酸片段的碱基序列,如图1所示。

Sanger测序原理示意图

图1 Sanger测序原理示意图

  2、测序流程

  Sanger测序流程根据DNA复制和RNA反转录的原理设计,具体简述如下:

  ①分离并检测待测序的核酸模板DNA或RNA.
  ②适当比例的引物、模板、4种dNTP、酶(DNA模板选用DNA聚合酶,RNA模板选用反转录酶)依次加入4支反应管中,同时按一定比例分别加入一种荧光标记的ddNTP.
  ③引物结合到模板上,在酶的作用下核酸链从5'端向3'端延伸,4种dNTP根据模板序列依次掺入新合成链中。当ddNTP随机掺入时,由于其3'端缺乏羟基,无法与下一个dNTP生成磷酸二酯键从而导致新合成链终止延伸。ddNTP掺入的随机性最终使得异常终止的核酸片段具有不同长度。
  ④利用聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4个反应管中的产物,由于每一反应管中仅含有一种ddNTP(如ddGTP),故此管中长度各异的核酸链都应在此种碱基(如G)处终止,所以一条泳道中不同带的DNA其3'端均为同一种ddNTP.
  ⑤读取荧光数值。根据4条泳道分别代表的碱基和各泳道中条带的位置,可直接从荧光结果上读出互补链的序列。

  3、应用

  1.临床应用

  (1)单基因疾病的产前诊断。如果需要检测的目的基因明确,可以对羊水细胞进行PCR后测序,从而发现家族史明确的遗传性疾病。
  (2) HLA配型。已成熟地运用于器官移植、骨髓移植等。
  (3)疾病的基因诊断。可对致病基因明确的单基因遗传病进行基因诊断,特别有利于诊断多基因位点突变。它可以根据需求,对基因的某个位点、片段甚至整个基因进行测序,从而避免只检测热点突变或SNP而导致的遗漏。
  (4)个性化用药。药物在吸收、代谢、分布和发挥疗效时,都离不开与相应的蛋白分子结合。基因变异如果使这些蛋白质功能异常,则有可能影响药物疗效,导致不良反应。通过检测拟使用药物相关的蛋白质编码基因,可以指导个性化用药。

  2.法医鉴定

  通过检测13~18个基因组中的位点,可以区别绝大多数个体,从而在法医及亲子鉴定方面发挥作用。

  3.病原 体检测

  利用Sanger测序法可快速鉴别病原体,并能及时发现新的毒株和突变,区别强毒株及弱毒株,有利于进行病原流行病学方面的研究,确定相应的预防和控制措施,并明确它们在人群中的分布规律。

  4、注意事项

  为了保证测序的顺利进行,需要注意以下事项:

  ①确保模板分子的完整性且无杂质污染;
  ②严格遵循引物设计原则,精准设计引物,保证其特异性;
  ③确定模板特点及标记方式后,选择适当的测序反应试剂盒及仪器;
  ④测序电泳前必须对PCR产物进行纯化;
  ⑤使用毛细电泳管进行电泳时,需提前充分了解毛细管的参数及灌注胶的情况。

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