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一种新型酶联级联测序技术——焦磷酸测序技术

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-08-03

  1、原理

  焦磷酸测序(pyrosequencing)是由波尔·尼伦和穆斯塔法·罗纳吉于1996年提出的一种基于聚合原理的DNA测序方法1+2焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

  当测序引物与模板DNA退火后,在DNA聚合酶(DNA polymerase) 、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)4种不同酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合时释放的焦磷酸基团(PPi)与一次荧光信号的释放耦联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DNA序列和定量分析序列变化的目的。

  焦磷酸测序进行定量分析的原理如图1所示:

  当与模板互补的dNTP与引物的末端形成共价键后,dNTP的PPi释放出来,且PPi的量与和模板结合的dNTP量成正比。

DNA合成与焦磷酸释放

图1 DNA合成与焦磷酸释放

焦磷酸测序中的酶级联化学发光反应

图2 焦磷酸测序中的酶级联化学发光反应

  ATP硫酸化酶催化PPi形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,而氧化荧光素会发出与ATP量成正比的可见光信号。而每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比(图2)。

  通过上述复杂的过程,我们就能够通过焦磷酸测序对所需分析的DNA序列进行定量测定。

  2、应用

  焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术,其重复性和精确性可与Sanger测序相媲美,而测序速度则大大提高,非常适合对已知的短序列进行重测序分析。在遗传病分子检测中。焦磷酸测序主要用于SNP快速筛查、点突变检测和DNA甲基化定量分析。

  (1)SNP快速筛查

  由于焦磷酸测序技术具备同时对大量样本进行测序分析的能力,因此我们可以对上百个样本中的单个SNP位点或同一样本中的多个SNP位点进行筛查,这就为大通量、低成本、快速地进行SNP筛查研究提供了理想的技术平台。

  (2)点突变检测

  同样道理,我们同样可以采用焦磷酸测序技术对多个已知的致病点突变进行测序分析,能够满足对特定DNA片段突变检测等方面的应用。

  (3)DNA甲基化定量分析

  目前DNA甲基化分析常用亚硫酸氢盐转化的方法,DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR可将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生甲基化的DNA的“C”发生上述转化。

  因此,甲基化的问题将被转变为C/T突变的问题。如前所述,焦磷酸测序可对特定序列进行定量分析,这样我们就可以通过计算特定CpG位点中C/T的比例来进行DNA甲基化的定量分析(图3)。

采用焦磷酸测序进行DNA甲基化的定量分析

图3 采用焦磷酸测序进行DNA甲基化的定量分析

  3、实验流程

  (1)引物设计和标记

  与普通PCR类似,焦磷酸测序需要设计一对PCR扩增引物,扩增产物长度为100~300 bp,扩增产物主要包括需要进行测序分析的DNA片段。其中1条PCR引物的5‘端需标记生物素。此外,还需设计1条测序引物,该引物设计在上述生物素标记引物的互补链上,位置位于需测序分析的DNA片段前方(图4)。

PCR扩增引物与测序引物的设置示意图

图4 PCR扩增引物与测序引物的设置示意图

  粗体字表示PCR扩增引物,其中下游引物用生物素标记。斜体字表示测序引物,测序引物后面的是需要测定的序列。

  (2)PCR产物预处理

  将PCR产物与结合缓冲液。亲和素磁珠共同孵育,使得带有生物素标记的1条PCR产物链与亲和素磁珠结合。

  (3)PCR 产物的吸附、洗脱

  将结合有PCR产物的磁珠吸附在磁棒上,依次通过70%乙醇、变性缓冲液和洗脱缓冲液处理,随后将磁珠释放到含有测序引物的退火缓冲液中。

  (4)加热变性

  通过加热将PCR产物和测序引物进行变性。

  (5)程序设定 及运行

  在电脑软件中设置需要测定的DNA序列,并开始程序运行。

  (6)结果判读

  程序运行结束后,使用配套的软件对数据进行分析,读出测定的序列,并获得序列突变或甲基化变化的信息。

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