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基因检测过程中如何控制检测结果的质量

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-08-04

  检测过程中检测方法的选择、检测人员、检测设施与设备状况、所用试剂、检测环境等涉及检测过程、结果分析、结果录入等各个环节的因素均可能影响检测结果的质量。质量控制(qualitycontrol)活动应该覆盖检测过程的所有环节。

  1、质量控制的要素

  质量控制不仅仅指室内质量控制(internalqualitycontrol,IQC)和室间质量评价(external quality assessment, EQA),还应包括其他许多作业技术和活动。质量控制涵盖检测样品接收到检验结果输出的全过程,涉及操作与检测人员、检测所使用的材料、检测设备、检测程序和检测方法以及测量时环境条件等各个环节。

  (1)人员

  人员的质量控制是指所有与检测活动有关人员资质、培训、考核和监督等,保证其具备岗位所需的专业知识、操作技能、工作经验及能力。

  (2)设施与环境

  设施与环境的质量控制目标是有助于基因检测项目的正常实施。根据开展项目的不同,实验室设施与环境需求可能不同。一般来讲,基因诊断实验室的设置和环境应当满足《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》及其附件《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》要求,并充分考虑生物安全。

  (3)仪器设备及外部供应品

  可能影响实验结果的主要仪器设备及外部供应品(试剂、质控品等)是质量控制的主要环节之一。仪器设备及外部供应品的质量控制主要是指对仪器设备及外部供应品的验证、评价,接受或拒收及存放的程序,检验校准及维护等环节进行质量控制和质量确认。

  (4)方法性能规格的建立和确认

  遗传病诊断方案和方法应当首先采用国家标准、行业标准或行业技术规范,如染色体病的产前诊断技术应当符合中华人民共和国卫生行业标准《胎儿染色体异常的细胞遗传学产前诊断技术标准》(WS322.2-2010)。无上述标准时,可以参考国际同行业的技术标准和规范,如美国临床遗传和肿瘤学分子检测方法指南( Molecular Methods for Clinical Genetics and Oncology Testing; Approved Guideline,MM01-A3),美国医学遗传学会( American College of Medical Genetics,ACMG)也对多种常见遗传疾病的分子诊断不定期公布和更新临床检测指导。

  实验室必须对所使用检测方法的准确度、灵敏度等特性进行确认。引进在我国取得注册登记的国外方法(试剂盒)时,实验室应当获得并验证该方法的准确度、精密度、检验结果的报告范围等性能。实验室自行建立的方法也必须同时建立每一种方法的性能特性档案,一般包括准确度、特异性、检测结果的报告范围、干扰因素的影响等。

基因检测

  2、实验室内部质控与外部质控

  (1)质控品的使用与要求

  遗传病检测实验一般包含如下程序:样本处理、细胞培养或者酶切/扩增/杂交、目标检测与分析。在所有环节中应当尽可能使用适当的质控品进行质控。涉及人基因组的检验项目包含如下质控品:①阴性质控品:判断假阳性反应,人类遗传病检测中应当使用经过确认的正常对照或者标准品;②阳性质控品:判断假阴性反应,需要考虑纯合子、杂合子等不同阳性情况;③内对照:监测提取/酶切/扩增/杂交等环节的效率是否符合要求;④空白对照(无模板):检测实验体系是否存在外源污染。

  此外,根据实验特点,还应当适时采用标准相对分子质量Marker、片段长度Marker等对照品进行质控。

  实验室应当保证外来质控品的稳定性和同质性,以避免质控品本身带来的影响。质控品应当首选标准品,在无标准品或标准品不易获得的情况下,阴性质控品也可以选用经过确证的已知阴性样本;阳性质控品也可以选用经过确证的已知阳性样本,或者经过验证的疾病相关细胞系或体外构建的含已知突变基因的质粒等,优选的原则是对照标本的特征尽可能接近临床样本。在检测目标可能存在多种突变可能性或者复杂复合突变,检测结果不可预测时,可以采用最常见的一种突变作为阳性对照,此时,若出现对照之外的结果,应当考虑进行确证实验。

  (2)室内质量控制

  人员、实验室设备/设施 、试剂与耗材、检测与分析方法,均可能影响遗传病检测实验质量的可靠性。实验室应当对涉及检测各阶段(检测前、检测中、检测后)可能存在不确定性或者产生偏差与错误的环节进行有计划的监督和内部质量控制。室内质量控制应当包含所有的检测项目,分为日常质控与阶段性质控两种形式。遗传病检测的室内质量控制应当符合《个体化医学检测质量保证指南》要求。

  日常室内质量控制:遗传病检测的各个环节均应当根据实验特征设置质控措施。一般检测实验中需要同时设立阴性质控品(正常对照)、阳性质控品、内对照,基于PCR的检测实验还应当设立不含模板的空白对照。质控样本要与待检样本同时检测。对分子诊断中的定量检测,如游离DNA浓度等,可以采用标准曲线或者统计学方法进行室内质量控制。一次检测中质控品的设置数目与检测系统的稳定性、试剂的稳定性、罕见突变质控品的可获得性、检测样本的数目等相关。一般情况下可按照以下原则设定室内质量控制:①如果只检测1个基因突变,且标本量不多于30份,一套质控样本即可。部分基于正常对照进行结果判断的相对定量实验,可适当增加阴性(正常)对照品的数量。②当同时检测多个突变基因时,可以根据实验室自身条件,可只设立能最灵敏地反映检测问题的2个或3个突变基因的阴阳性质控品,下次检测改用跟上次不同的基因突变的阴阳性对照,依次类推,循环往复。

  进行产前诊断的检测项目,除了考虑外源污染外,还应当考虑母体细胞污染的可能性。因此,除外以上对照的设置,必要时应当进行母体污染排除实验。

  阶段性质控:除了在日常质控中使用标准品或者对照品外,还应当根据实际情况有计划地采用留样复测、相同样本的人员比对、不同方法相同样本比对、标准品检测、设备期间核查等方式对检测系统的稳定性、仪器设备、新进人员等环节进行阶段性质控。

  实验室应当规定室内质量控制相关的内容包括:质控品的来源;质控品的制备方案(如为自制质控品);质控样本的数量;质控样本的放置;质控规则;失控的判定规则;失控的处理和改进措施。

  (3)室间质量评价与外部质控

  室间质量评价是指实验室与本机构之外其他的独立实验室分析同一标本,通过收集、比对不同实验室间的检测记录和结果,判断、评价本实验室的检测能力。遗传病个体化检测实验室的室间质量评价活动应当符合《个体化医学检测质量保证指南》要求。实验室应当参加国家卫计委临床检验中心组织的室间质量评价。若国家卫计委未对该项目开展室间质量评价,需每年进行三家以上实验室,每次涉及三份以上样本的实验室比对。比对实验室应当首选经过遗传病检测质量管理认证的机构,有条件的实验室可参加美国病理学会(College of American Pathologists, CAP)和美国医学遗传学会(American Board of Medical Genetics, ABMG)组织的分子遗传能力验证项目。实验室应对每份室间评价结果进行分析和总结。室间质量评价结果不合格或实验室比对结果不符合的,应当分析原因,并采取相应的预防/纠正措施。

  3、标准操作程序

  标准操作程序(standard operation procedure, SOP)文件体系可以保证检测各环节的标准、有序进行,确保检测结果的真实性、准确性和可重复性48.实验室的SOP应涵盖所有的质量活动,包括管理性程序、技术性程序、检测项目操作程序和记录表单等。

  SOP文件及其相关记录表单一般由技术管理部门组织编写、审核、发放和修订;根据实验室管理、技术、检测方法等的变化适时更新,实验过程中所有操作和所有人员都应严格执行SOP,不能擅自修改。遗传病个体化检测实验室SOP文件包括但不局限于以下要素:

  仪器设备的维护保养程序;仪器设备的校准程序;仪器设备的操作程序;标准物质的管理和核查程序;临床标本的收集程序;临床标本的处理(核酸纯化)程序;临床标本的贮存程序;检测方法的选择及使用程序;核酸扩增及产物检测、分析的操作程序(根据实验室开展项目生成针对不同具体检测方法的多个SOP文件);标准方法证实与非标准方法确认程序;室内质量控制程序;试剂的质检操作程序;实验室消耗品购买、验收和贮放程序;实验室废弃物及生物污染的处理程序;实验室的清洁程序;文件控制程序;记录/报告的制作和保管程序;电子数据保护程序;保密管理程序;实验室安全管理程序;纠正和预防措施程序;抱怨/投诉处理程序;实验室人员管理程序。

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