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蛋白质组学中的飞行质谱检测技术

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-08-04

  早期的飞行质谱(time of flight, TOF)多为基质辅助激光解吸离子飞行质谱( matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS),在生命科学研究中,已成为目前检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具。

  在此系统中,信号由高速的模拟数字转化器转化并记录,核酸或者多肽在谱图上的位置取决于飞行时间,被测定的核酸、多肽以一系列峰的形式呈现,这些特异的系列峰可看成疾病的指纹图谱。

  其中,基于MALDI- TOF MS的蛋白质谱技术具有快速、准确、灵敏度高等特点,能够通过检测微生物的蛋白质指纹图谱达到鉴定微生物的目的,故而在微生物快速鉴定、耐药性分析、分型和毒力研究等领域具有广泛的应用。目前可对常见细菌、分枝杆菌、厌氧菌及真菌等多种微生物进行快速和准确的鉴定,错误率仅为0.1%,有望成为新一代病原微生物诊断的常规技术。目前临床微生物实验室中应用较多的质谱仪主要是德国布鲁克·道尔顿公司(Bruker Daltonics)的MALDI Biotyper 系统和法国生物梅里埃公司( BioMerieux SA)的Vitek MS系统。

  目前应用TOF技术进行核酸分析检测的设备是SEQUENOM公司(2014年该公司生命科学部被美国AGENABioscience公司收购)的MassARRAY平台,也是唯一获得美国FDA临床认证的核酸质谱平台。MassARRAY@平台最常用的技术是iPLEX和EpiTYPER.MassARRAYO 相对分子质量阵列平台是应用基质辅助激光解吸离子飞行时间高通量质谱技术来进行基因型和DNA甲基化水平的检测。基于MassARRAY相对分子质量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测,适合于有限数量明确位点的检测。该平台的EpiTYPER技术可以根据相对分子质量的大小精确地计算样品中DNA甲基化的程度。

  1、检测原理

  飞行质谱的原理是样品分析物与芯片基质(硅化合物)共价结合形成结晶后在质谱仪的真空腔中经高能激光激发,核酸分子解析为单电荷离子;在电场中离子飞行时间与离子的质量成反比,通过检测解析的核酸分子在真空腔中飞行的时间从而计算获得样品分析物的精确相对分子质量,进而得到分析物的基因型信息(图1)。该平台使用的是垂直飞行模式。

飞行质谱工作原理示意图

图1 飞行质谱工作原理示意图

  1.SNP分型检测原理

  单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms, SNP) 是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括转换(C/T、G/A)、颠换(C/A.G/T.C/G.A/T)、缺失和插入,数量很多,多态性丰富。目前认为,SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每500~1 000个碱基就有一个SNP,人类基因组上的SNP总量大概有3 X 10^6个。人类很多表型差异、对药物反应或疾病的易感性等都可能与SNP有关。

  MassARRAY国平台的iPLEX检测基因分型的原理,是对PCR扩增的目标序列进行MasEXTEND单碱基延伸反应,该反应是紧挨着SNP位点设计一段探针,在反应体系中以ddNTP替代dNTP,使得探针在SNP位点处延伸一个碱基即终止,在反应体系根据SNP位点的不同,探针将结合不同的ddNTP,生成不同相对分子质量的产物(图2)。延伸的产物与芯片基质结合形成化合物后,再通过飞行质谱进行基因型分析。

iPLEX技术检测SNP原理示意图

图2 iPLEX技术检测SNP原理示意图

  2.DNA 甲基化检测原理

  MassARRAY@相对分子质量阵列基因分析系统EpiTYPER DNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应(MassCLEAVE)和MALDI-TOF测序原理。与其他测序方法检测DNA甲基化一样,MassARRAY@平台也是应用经过亚硫酸盐处理,DNA中的未甲基化的胞嘧啶(C)转为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶不会发生改变,甲基化的胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶(转变成U)由于相对分子质量不同,因此可以区分。

  利用5‘端带有T7启动子的引物进行PCR扩增,产物经虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)处理后,转录并行碱基特异性酶切反应(MassCLEAVE),最终生成不同相对分子质量的检测产物(图4-3)。酶切后DNA片段的大小和相对分子质量取决于亚硫酸盐处理后碱基的变化。

EpiTYPER技术检测DNA甲基化原理示意图

图3 EpiTYPER技术检测DNA甲基化原理示意图

  2、位点检测流程

  (1)引物设计  已知rsID的SNP通过NCBI网站获得待检测位点对应的碱基序列,对于无rsID的位点,手动输入待检测位点前后50~100 bp的核苷酸序列。使用在线软件进行引物设计。将所有待检测的SNP位点整理成fasta 格式。
  (2)多重  PCR反应和延伸反应。
  (3)点样  在Nano点样仪( Nanodispenser)中编辑需要点样的位置,一般加到芯片( SpectroCHIP)。上的样本体积以5~12 nL比较合适。
  (4)质谱分析  将芯片(SpectroCHIP)于MassARRAYh质谱仪结合Typer工作平台进行质谱分析。

  3、技术特点

  (1)高通量  一张芯片可对384个样本进行多重检测,每个体系最多可实现40重反应,而且通量可根据客户要求进行个性化调整。
  (2)高性价比  无须荧光标记,仅需合成普通引物,单个分析成本低;适用范围广,可同时检测几十到成千。上万个样本,检测几十到成百上千个位点。
  (3)高灵敏度  分析所需样本量少,且检测精度高,并能进行定量分析。
  (4)高灵活度  功能多样,适用于SNP分型以及DNA甲基化定量分析。而且,一 张芯片。上样本数量和位置可随意选择。同时,一张芯片上样本和位点检测匹配也可随意选择。

  4、应用领域

  1.SNP分型质控

  案例1:华大基因一耳聋基因检测

  华大基因在四年前启动耳聋基因检测,使用的平台就是MassARRAY⑧核酸质谱仪,该项目检测4个耳聋相关基因共20个位点,在一个反应体系内进行。

  案例2:达安基因一重大疾病易感基因检测

  达安基因通过非医院渠道(保险公司、银行VIP、健康管理公司)开展重大疾病易感基因检测,业务从2015年7月起,至今已检测达5万人份,该项目通过分析肿瘤、高血压和糖尿病等相关基因,共200多个位点,在10个反应孔中进行。达安基因将进一步在质谱平台上开发肿瘤突变基因检测、地中海贫血基因检测,以及儿童优势基因、易感基因检测等项目。

  案例3:AgenaBioscience一ADME个体药物代谢基因型检测试剂盒

  Agena Bioscience开发的ADME个体药物代谢基因型检测试剂盒包含> 99% FDA评估的基因标记物,是目前最为实用的测定药物代谢遗传学的方法。涵盖34个基因中的185个药物代谢标记,包括变异、插入、缺失、拷贝数变异、三等位基因标记等,可以帮助指导个体安全用药和药物研发。

  其系列产品还包括:华法林试剂盒(CYP2C9 * 2; * 3;VKORC1 - 1639);CYP2D6v1.1 药物代谢试剂盒;CYP2C19 Panel1 v1.0药物代谢试剂盒; CYP2C9/VKORC1 Panel1 v1.0 药物代谢试剂盒。

  类似案例还有北京博奥、广州达安基因等服务类公司。

  2.病原体检测

  案例1:华大基因HPV基因检测

  人类乳头瘤病毒( human papillomavirus, HPV)与宫颈癌关系密切“.2008 年,Harald zur Hausen因解析HPV和宫颈癌的关系而获得诺贝尔生理学或医学奖。HPV基因检测比传统的宫颈癌筛查方法更早发现宫颈癌前病变,有利于疾病的早发现、早诊断、早治疗。因此,华大基因采用飞行时间质谱技术及高通量测序技术,对公认的14种高危型HPV及两种常见低危型HPV进行精确分型,适用于临床检测及大规模宫颈癌筛查项目。

  案例2:华大基因一HBV耐药及分型基因检测

  华大基因开发出可一次检测乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)分型和抗病毒药物相关的11个耐药位点的变异信息,区分不同分型的HBV,全面覆盖病毒信息,能够及时发现病毒耐药,有助于制定个体化的抗病毒治疗方案。

  3.SNP 位点等位基因频率计算

  案例1: 2007年由美国哈佛大学医学院Garraway教授领衔,美国、日本、瑞士、奥地利和德国5国26个机构的53名专家参加的联合研究,在Nature Genetics (2007)上首次揭示了人类肿瘤基因突变的频率和分布,为肿瘤分类、发生机制和治疗干预提供了依据。专家们将MassARRAY@质谱与两种测序法比较,最终一致选择了高灵敏度和高特异性的MassARRAY@技术。结果证明,质谱法检测突变比测序更灵敏且经济。

  案例2:安徽医科大学张学军团队,从2009年引进该技术后,已经连续四年在Nature Genetics和New Engl J Med等高影响力杂志发表17篇GWAS研究论文,所有GWAS验证工作均在MassARRAY质谱平台完成,其效率之高,成为国内乃至国际GWAS研究的典范。张学军教授也为此在”GWAS 2011 ,机遇与挑战“的国际论坛中与《自然遗传》主编MylesAxton博士一同担任共同主席。

  案例3:上海市糖尿病研究所贾伟平教授与韩国、新加坡等联合完成了迄今为止样本量最大的东亚人群2型糖尿病全基因组关联研究,发现19个可能的潜在易感位点,并最终确认了8个风险基因GLIS3、PEPD、FITM2 - R3HDML - HNF4A、KCNK16、MAEA、GCC1- PAX4、PSMD6、ZFAND3.

  4.体细胞突变检测质控和验证

  案例1:中山大学肿瘤医院一肿瘤相关突变基因检测

  中山大学肿瘤医院是全国率先单独成立分子诊断科的肿瘤专科医院,他们曾经尝试过各种平台,最后肿瘤化疗相关基因、易感基因及鼻咽癌的筛查均转移到MassARRAY@平台上,主要考虑成本低、操作简单、分析容易、数据结果稳定可靠、开放性等优点。

  案例2:2012年英国萨顿癌症研究所Perkins首次从晚期肿瘤患者外周血浆DNA中检测肿瘤体细胞突变。他们从晚期肿瘤患者的外周循环血浆DNA中,成功检出肿瘤体细胞突变,该结果与匹配的石蜡肿瘤组织样本完全吻合。结果表明,总外周循环血浆DNA水平与患者预测生存期相关。此外,还证实了Sequenom设计优良的OncoCartaTM试剂盒,在肿瘤活检不能反复进行时,能通过扫描外周循环血中肿瘤DNA找到肿瘤标志物。

  Sequenom公司于2008年开发出首个OncoCartaTM癌基因体细胞突变检测试剂盒,涵盖公认的19个癌基因的238个热点突变,覆盖90%~95%的已知药物靶标,为临床研究试验提供经济有效的突变筛查。

  5.甲基化定量分析

  案例:陈竺院士和陈赛娟院士团队在中国首先引进该技术,并成功用于SNP分型和甲基化分析。在Nature Genetics(2011)发表白血病研究中对9例配对样本,用外显子组测序技术鉴定出266个体细胞突变,同时采用DNA甲基化免疫沉淀结合芯片技术,获得3878个基因甲基化变异。继而用MassARRAY技术,对509名健康对照和98例患者进行体细胞突变和甲基化定量分析的大样本量验证。证实DNMT3A突变与急性白血病高发病率及预后不良密切相关,鉴定出一个新的生物标记物。

  6.基因表达定量分析

  案例:美国Sequenom技术创始人美国科学院院士CharlesCantor博士,从1992年发明免疫PCR,历经20年首次发表多重免疫PCR检测。该技术将免疫PCR结合竞争性PCR和多重PCR定量检测蛋白质(抗原或抗体),其灵敏度较传统蛋白质检测方法提高100倍,也就是将样本的需求量降低为原来的1/100~1/10.

  7.CNV 检测分析

  案例:卢煜明教授采用CNV检测技术,率先在Nature Medicine (2007)发表重大研究成果一唐氏综合征无创性产前检测,开拓了无创性产前诊断的新里程。

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