前沿资讯

基因表达谱芯片技术与具体运用

来源:《遗传病分子基础》  作者: 曾溢滔  日期:2020-08-05

  表达谱(expression profile)全称基因表达谱( gene expression profile) ,是研究特定细胞群或组织在特定阶段所有基因表达情况(包括基因是否表达、表达丰度、不同组织、不同发育阶段以及不同生理状态下的表达差异)的方法,是当前探讨性状与基因之间关系的主要方法。

  表达谱芯片是采用cDNA或寡核苷酸片段作探针,固化在芯片上,将待测样品(处理组)与对照样品的mRNA以两种不同的荧光分子进行标记,然后同时与芯片进行杂交,通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度比值来检测基因表达水平的变化。

  医学上表达谱芯片广泛应用于分子诊断、药物筛选和疾病相关基因发现研究等领域。目前常用的表达谱芯片主要有美国Agilent 公司、Affymetrix公司和Illumina 公司等。它们的原理基本一致,如图1所示。

表达谱芯片原理

图1 表达谱芯片原理

  1、技术特点

  基因芯片很适合用于基因表达分析。因为人类基因组中已编码DNA与未编码DNA的比率是很低的,表达序列仅占整组基因的3%,所以以杂交为基础的副链分析可有效降低人类整组基因研究的复杂性。基因表达的特征描述涉及几十至上百种基因,用传统方法去分析没有实用价值。

  全基因组表达谱基因芯片的应用,可以很好地解决这一问题,在稳定的转录水平上,可灵敏地、完整地给出细胞或组织样本一系列生理状态的分析结果。根据基因的这些共表达信息,可以研究已知基因及其编码蛋白质的新功能、注释未知基因及蛋白质的功能,还可以研究相关基因的调控及其编码的蛋白质之间的相互作用。

  2、应用领域

  对mRNA表达而言,更重要的问题是特定基因在不同细胞类型中,或不同发育、生长阶段,或不同生理、病理状态下,表达水平均会发生不同的变化。高通量基因表达谱芯片分析仍然是该方面研究的经典技术。

  以Agilent公司的基因表达谱芯片为例,该芯片具有独特的喷墨原位合成技术,探针长60 mer,平均CV<10%,具有良好的可重复性,相关系数R?>0.95,芯片数据结果与qPCR数据结果具有良好的相关性,相关系数R?>0.9.中国科学院植物研究所林荣呈研究员课题组及其合作者,通过Agilent拟南芥表达谱芯片筛选,同时结合其他研究技术,探索发现两对蛋白质- PIF1/PIF3(bHLH型转录因子)与HY5/HYH(bZIP型转录因子)在协调光与活性氧关系上存在双向的关系和作用机制,证明其在植物响应和适应自然界不断变化的光环境中的重要意义。

  表达谱芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比,它可以在一张芯片同时对多个患者进行多种疾病的检测,无须机体免疫应答反应期,能及早诊断,待测样品用量小;能特异性检测病原微生物的亚型及变异;使得医务人员在短时间内可以掌握大量的疾病诊断信息,这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。

  在肿瘤诊断方面,检测基因突变对于阐明肿瘤及遗传病的分子机制、疾病的早期诊断具有重要意义。例如,Perou等是最早一批乳腺癌基因表达谱研究者,他们使用含有8000多条人类基因/克隆的表达谱基因芯片,对临床获得的乳腺癌标本进行mRNA表达的检测。

  研究者首先筛选出与乳腺癌临床表现密切相关的一批基因(496个,称为intrinsic gene subset)。之后通过聚类分析(cluster)归纳这批基因的变化规律,进一步把乳腺癌分为7种基因型(luminal A. luminal B、luminal C、HER2 - enriched、basal-like、claudin-low和normal breast-like)。

  上述基因型分类经各国研究人员验证,明确了基因分型与病理分型/蛋白质层面检测指标之间的密切关系,经过临床病例验证后,最终形成了具有临床预后 价值的、可以用病理检验手段来实施的分子分型系统(luminal A、luminalB、luminal-HER2阳性、HER2阳性和basa-like五型)。该分型被国际权威乳腺癌治疗指南性文件如《StGallen早期乳腺癌共识》等采用,已成为临床诊断的通用标准。

  当前临床使用最广的21基因检测工具(Oncotype DX)是通过对3项研究共计447例患者进行分析,从250个候选基因中筛选出由21个基因组成的预后评估工具。该工具针对的是雌激素受体阳性、接受激素治疗的早期乳腺癌患者,可以为患者提供激素治疗的复发风险评分,根据评分把患者区分为低、中、高危,为医生确定最佳治疗方案提供信息。

  在肿瘤鉴定方面,伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)是一种多见于热带非洲儿童的恶性肿瘤,该瘤有明确的地区性高发和流行性分布。主要临床特点是单个或多发的下颌骨肿物,生长迅速,常累及肾、肠、卵巢及中枢神经系统。此瘤进展迅速,致死快,若能恰当治疗,50%以上的病例可以治愈。弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B celllymphoma,DLBCL) 是成人淋巴瘤中最常见的一种类型,并且是一组在临床表现、组织形态等多方面具有很大异质性的恶性肿瘤。

  典型的伯基特淋巴瘤与DLBCL是容易鉴别的,但在患有DLBCL的东方人的肿瘤组织中可有伯基特淋巴瘤样的分化,瘤细胞中等大小或偏小、一致,吞噬性组织细胞多见其中,容易误诊为伯基特淋巴瘤。Dave 等使用U133Plus2.0芯片研究了两种淋巴型患者的基因表达差异,从基因表达的角度对病情进行了准确的诊断,准确区分了25对病例。

  作者通过研究两种肿瘤患者的基因表达情况,发现在伯基特淋巴瘤患者中,以下基因的表达情况与DLBCL患者明显不同: c-myc基因和生发中心B细胞基因亚群高表达,主要组织相容性复合体I和转录因子B靶基因低表达等指标。通过这些指标可以轻易地将伯基特淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤区分开来。通过特异基因表达差异区分肿瘤性质,并提供给药参数,改变用药剂量的患者,治疗效果明显提高。

  在治病机制研究方面,在儿童白血病患者中,80%的患者经过治疗可以达到良好的效果。不幸的是,在剩余20%的儿童患者中,治疗效果不明显,表现为患者对药物具有抗性。为了一探究竞,Holleman、Amy等采用U133A芯片研究了白血病人群中淋巴母细胞的基因表达情况,了解了抗药性亚群的疾病表达模式,筛选出一系列标志基因,为医学治疗提供了新的靶位,以提高治疗效果及其效率(251 ;Valk、Peter等采用U133A芯片对白血病的生物学机制进行研究,并对白血病亚型进行研究和分类,发现了与亚型相关的基因群,丰富了白血病治疗的理论和应用基础。

  在药物筛选方面,基因芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机制、药物活性及毒性评价方面都有其他方法无可比拟的优越性,能够从基因水平解释药物的作用机制,可以用基因芯片分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达的差异,国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标,检查药物的毒性或副作用。

  例如,MichaelWilson等使用包含有肺结核杆菌基因组PRF97%序列的基因芯片,对应用抗结核杆菌药物异烟肼诱导前后表达的变化进行研究,结果证明肺结核杆菌中脂肪酸合成酶I、FbpC、efpA.fadE23、fadE24和基因发生改变与耐药性有关,并为新药物作用的靶目标研究及指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成提供指导。

手机(24小时)18030879397

在线咨询:09:00~17:30