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二联体亲子鉴定中二代测序技术的实践

来源:《行业杂志》  作者: 吴玉剑  日期:2020-09-07

  与传统的毛细管电泳STR分型方法相比,二代测序技术具有测序片段短、可深度测序、可准确区分序列差异、可同时进行多位点的检测等优点,为疑难案例和样品的DNA分析提供了解决方案,在亲子鉴定领域必将发挥越来越重要的作用。

  1、案例和方法

  1.1 简要介绍

  我中心接收的鉴定委托中需进行二联体亲子鉴定情况3例(1号父,1号子;2号父,2号子;3号父,3号女)。

  1.2 检验方法

  1.2.1 毛细管电泳STR分型检测

  使用AGCU EX22试剂盒(无锡中德美联生物技术有限公司)进行STR复合扩增,使用3500XL基因分析仪(Thermo Fisher公司)和GeneMapper?ID-X v1.5软件进行电泳和数据分析。

  1.2.2 二代测序STR分型检测

  使用Precision ID GlobalFilerTM NGS STR Panel v2试剂盒(Thermo Fisher公司)在Ion Chef工作站中构建文库和制备模板;使用Ion S5 Sequencing Kit和Ion 520?Chip型芯片(Thermo Fisher公司)在Ion S5测序仪上进行测序;使用Torrent_Suite_v5.2.1软件对测序数据进行筛选及分析。

  2、结果

  2.1 毛细管电泳STR分型结果

  使用AGCU EX22试剂盒对3个案例样品进行STR分型检测,结果显示每个案例中均存在一个基因座不符合孟德尔遗传规律。案例1的D18S51基因座,父亲分型为14/17,儿子为15,经计算,累计亲权指数(cumulative paternity index,CPI)为1.19E+05.案例2的FGA基因座,父亲分型为23,儿子为24,经计算,CPI值为1.51E+04.案例3的D16S539基因座,父亲分型为12/13,女儿为11/14,经计算,CPI值为4.46E+04.虽然上述3个案例中CPI值均大于10000,依据《亲权鉴定技术规范》(GB/T 37223-2018),支持被检测男子是孩子的生物学父亲,但是3个案例中CPI值均较小,案例2的CPI值已经很接近临界值。为了对毛细管电泳STR分型结果做进一步验证,同时增加新的检测位点,故继续使用二代测序技术对上述6个样品进行了检测。
 

案例中突变基因座的二代测序STR分型结果

图1 案例中突变基因座的二代测序STR分型结果

  2.2 二代测序STR分型结果

  本实验使用的Precision ID GlobalFilerTM NGS STR Panel v2试剂盒中包含31个常染色体STR基因座和4个性别相关基因座,覆盖了AGCU EX22试剂盒中的全部22个基因座,同时还包括额外的10个常染色体STR基因座(D12ATA63、D14S1434、D1S1656、D1S1677、D22S1045、D2S1776、D3S4529、D4S2408、D5S2800、D6S474)。结果显示,3个案例中的6个样品应用二代测序得到的STR分型结果与应用AGCU EX22试剂盒结合毛细管电泳检测的STR分型完全一致。图1和表1所示为3个案例中突变位点的二代测序STR分型结果以及核心序列碱基组成信息。在新增的10个常染色体基因座,3个案例中亲子对的STR分型均符合孟德尔遗传规律(见表2)。增加新的基因座后,3个案例的CPI值显着提高,分别达到了4.19E+08、1.11E+07、6.85E+06.

表1 案例中突变基因座的核心序列信息

案例中突变基因座的核心序列信息

表2 二代测序中新增位点的STR分型结果

二代测序中新增位点的STR分型结果

  3、讨论

  二代测序,也叫下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS),可以一次平行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,所以又被称为高通量测序。二代测序技术相对于传统的毛细管电泳STR分型检测有很多优点,在DNA鉴定领域越来越受到重视.传统STR分型方法受荧光标记的种类限制导致检测位点有限,一般的商业试剂盒检测的STR基因座都在25个以内。二代测序不受荧光标记的限制,可以一次检测几十到几百甚至几千个位点,可显着提高个体识别和亲子鉴定的检测效能,在常规样品检测和有突变等特殊样品检测方面都具有很高应用价值.

  本次测序采用的Precision ID GlobalFilerTM NGS STR Panel v2试剂盒包含31个常染色体STR基因座,在样本存在突变时进行二联体亲子鉴定仍然可以达到较高的CPI值,提高了结果判定的准确性。传统STR分型技术策略是通过毛细管电泳检测STR基因座的长度多态性,得到的只是等位基因的长度信息,不能反映其中的序列信息。二代测序STR分型技术既分析长度多态性又能分析序列多态性,能够发现长度相同但序列不同的等位基因亚型,获得更多的遗传多态信息。本实验发现在D12S391等8个基因座上存在等位基因亚型,其中在D21S11基因座上的等位基因亚型数量最多,与之前的报道一致。另外,传统STR分型方法受电泳影响比较大,电泳漂移等因素产生的干扰峰如OL峰影响等位基因的分型判断,而二代测序直接读取序列信息可排除此类干扰。

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