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去除PCR抑制剂效果的DNA提取纯化方法探析

来源:《杂志文摘》  作者: 孟琴  日期:2020-09-24

  PCR抑制剂广泛存在于DNA生物检材中,会随提取的DNA一起,影响PCR反应的各个环节,继而降低DNA检测成功率,增加了DNA检验的难度。笔者自制了几种含有常见抑制剂的生物检材,用三种方法提取纯化,并对其检验效果进行比较,为亲子鉴定实践提供参考依据,现报道如下。

  1、材料和方法

  1.1 样本

  取新鲜人血,稀释100倍;取三种方法的专用套管各8个,编号为A1-A8,B1-B8,C1-C8;每个管中先加入稀释血液10μL,再在1~7号管中分别加入铁锈(10mg)、泥土(10mg)、蓝色牛仔布(1cm×1cm,剪碎)、黑墨水(10μL)、油污(10μL)、果酸(10μL)、锡纸(1cm×1 cm,剪碎),8号为空白对照。

  1.2 DNA提取

  分别采用以下三种方法进行DNA提取纯化。

  (1)Automate法:使用Automate细胞纯化仪(美国AB公司),按照相关说明进行DNA提取。(2)博坤磁珠法:使用博坤自动化提取工作站(长春市博坤生物科技有限公司)及ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒,按照相关说明进行DNA提取。(3)D盾硅珠法:使用D盾超敏DNA提取试剂盒(上海惠文生物科技有限公司),按照相关说明进行DNA提取。上述三种方法均采用20μL洗脱体系。

  1.3 DNA扩增、检测及分析

  采用VeriFiler?Plus试剂盒(美国AB公司),10μL体系(包括缓冲液4μL,引物2μL,模板4μL),在9700型PCR扩增仪(美国AB公司)上进行28次循环扩增。扩增产物用3500xl型遗传分析仪(美国AB公司)进行检测,GeneMapper ID X分析软件分析结果。

  检验成功的评价标准:样本所有基因座均能正确分型,获得的谱峰峰高大于1000相对荧光单位(RFU),杂合子两个峰高比例在70%以上,无或少杂峰等干扰因素。本实验各个环节均保持完全一致,确保无其他可能的因素影响结果的准确性,结果重复性较好。

  2、结果

表1 三种方法提取生物检材的检验结果及峰高均值

三种方法提取生物检材的检验结果及峰高均值

  “+”为检出、“-”为未检出;“/”后为峰高均值(RFU)

  实验结果见表1.博坤磁珠法检验结果的峰高均值普遍高于其他两种,由高到底依次为:空白对照>蓝色牛仔布>果酸>锡纸>泥土>油污>铁锈>黑墨水;D盾硅珠法检验结果的峰高均值由高到低依次为:空白对照>油污>铁锈>果酸>泥土>锡纸>黑墨水>蓝色牛仔布;Automate法较其他两种方法在检验成功率、峰高均值、均衡性方面均处于劣势,蓝色牛仔布、黑墨水和油污均未获得完整基因分型。

  3、讨论

  PCR抑制剂的主要抑制机制是抑制DNA聚合酶的活性、阻碍样本DNA模板与引物结合、形成引物二聚体和使离子浓度改变。目前市面上销售的纯化试剂盒不断改良优化,在去除抑制剂方面取得了显着成效。

  本次实验结果显示,博坤磁珠法操作相对简便、快捷,去除抑制剂的效果整体不错,尤其是染料、果酸效果最佳。D盾硅珠法技术稳定,方法成熟,对油污、铁绣去除抑制剂效果最好。Automate法自动化程度较高,但去除抑制剂效果相对较差,有待进一步提高。

  根据此结果,实际案件检验中,实验室可以因“材”施“法”,根据不同的检材种类,采用不同方法做到个性化处理,选择更适合的提取纯化。

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