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聚合酶链反应DNA分析技术(PCR技术介绍)

来源:《DNA检验技术》  作者: 李民  日期:2020-08-11

  聚合酶链反应( polymerase chain reaction, PCR)是一种体外扩增特异性DNA片段的技术,可在数小时内获得近百万个靶DNA片段的拷贝,改变了传统的重组克隆复制靶DNA片段的技术概念。PCR技术操作简单,具有高灵敏度和高特异性,从而使法医DNA分析技术发生了深刻的变化。PCR及其衍生出的各项技术已在法医学鉴定中得到了广泛的应用。

  一、PCR基本原理

  PCR扩增靶DNA的过程类似于体内DNA的半保留复制。它是利用人工合成的一对寡核苷酸引物( primer) , 分别与待扩增DNA片段的两侧翼序列互补,在DNA聚合酶催化下,以靶DNA序列为模板,4种dNTP( dATP、dTTP、dCTP和dGTP)为原料,经过高温变性、低温退火和中温延伸三步的循环,使靶DNA片段经过约30个循环周期后达到百万倍的扩增(图1)。

  变性( denaturation) :指通过加热(通常加热至90C以上)使模板DNA双链间的氢键断裂,双链解离形成两条单链DNA的过程。

  退火(annealing):又称复性(renaturation),是指将反应体系降温(通常降至60℃以下),引物与单链模板DNA按碱基互补配对原则重新形成模板-引物杂化双链的过程。

  延伸( extension):指DNA聚合酶在适当温度(如:72℃)条件下催化4种dNTP原料,按碱基互补配对原则从引物的3‘末端开始掺人,沿模板由5’至3‘方向延伸,合成一条新的DNA链的过程。

  每经过一次高温变性、低温退火和中温延伸的循环周期,靶DNA片段便被复制一次。在以后的循环中,新合成的DNA链又成为下一循环的模板。以一个双链DNA模板分子为例,在第n次循环时,获得的靶DNA短片段数量为2^n-2n条。一般情况下,在完成30个循环后,理论上DNA拷贝数可达10^5~10^7.

聚合酶链反应过程

图1 聚合酶链反应过程

  二、PCR反应体系

  PCR反应体系的成分包括模板DNA、寡核苷酸引物、dNTP、反应缓冲液及Taq DNA聚合酶。

  1.模板

  DNA有机溶剂提取法、Chelex-100法或其他DNA提取方法均可用于制备模板DNA.因PCR技术对模板要求不高,目前常规采用Chelex-100提取基因组DNA.Chelex-100是一种螯合树脂,由苯乙烯和二乙烯苯的共聚体组成,含有成对的亚氨基二乙酸盐离子,能够螯合二价金属离子抑制DNA酶,保护DNA分子。Chelex-100提取法比较简单,具体方法如下:用5% Chelex-100 溶液悬浮检材细胞,根据需要加入蛋白酶K,经56℃孵化和100℃加温,在低渗条件下细胞膜和核膜被破坏后释放出DNA.离心后得到的上清液即可作为PCR反应的模板DNA液。

  Chelex-100法在同一离心管中完成提取过程,避免了样本DNA的损失,但提取的DNA纯度不如有机试剂提取法。残留过多的乙二胺四乙酸二钠( ED-TA)、盐和蛋白酶等均会影响扩增反应,案件检材中常见的抑制物如土壤、血红素衍生物等也会干扰PCR反应,因此有时需要对提取的模板DNA进行纯化处理。

  2.引物

  人工合成的寡核苷酸序列与靶DNA片段两侧翼的序列互补,因此引物序列限定了PCR产物的长度和特异性。限于TaqDNA聚合酶的链延伸活性,被扩增的靶片段长度一般在500 bp以下效果较好。引物一般长15 ~ 30 bp,G+C含量45%~55%.4种碱基随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象。

  引物内部不应形成二级结构,两条引物之间,尤其是3’末端不应有互补链存在。引物3‘端的碱基是影响PCR成功和特异性的关键因素,5’端的碱基组成对反应特异性的影响较小,可以根据检测分析要求进行修饰,如连接标记物、引入限制酶识别序列等。PCR体系中引物浓度通常为0.1 ~0.5 μmol/L. 若低于0.1 μmol/L, 则扩增产物量较少;若引物浓度过高,则易引起非特异性扩增或引物二聚体形成。

  3.三磷酸脱氧核苷酸

  每一种dNTP的终浓度应控制在20 ~ 200 μmol/L,4种dNTP浓度应均衡。dNTP浓度过高虽可加快反应速度,但亦可增加碱基的错误掺人率;dNTP浓度过低虽可提高实验的精确性,但会导致反应速度的明显下降。此外,由于dNTP可能与Mg2+结合,因此还应注意Mg2+浓度与dNTP浓度之间的关系。

  4.反应缓冲体系

  PCR反应中,缓冲液是一个重要的影响因素,尤其是其中的Mg2+会影响反应的特异性和扩增片段的产率。标准的缓冲体系为10 μmol/L Tris-HCl、pH8.3、50 mmol/L KC1、1.5 mmol/L Mg2+.Mg2+ 是Taq DNA聚合酶必需的激活离子,同时Mg2+浓度影响引物退火及延伸时特异性碱基的掺入。一般PCR反应中Mg2+浓度介于1.5 ~ 2.0 mmol/L 比较合适(对应dNTP浓度为200 mmol/L左右)。Mg2+ 过量会增加非特异性扩增并影响产率。此外,反应体系中加入小牛血清蛋白( bovine serum albumin, BSA, 100 μg/mL) 或明胶(0.001% )有利于聚合酶的稳定。

  5. Taq DNA聚合酶

  Taq DNA聚合酶是从一种嗜热水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分离提纯的,分子量为94kD,在70℃~75℃时具有最高的生物学活性,具有良好的热稳定性。该酶具有5'3‘聚合酶活性及5'3’外切酶活性,缺乏3'5' 外切酶活性。因此,在PCR反应中,TaqDNA聚合酶没有引物3‘端错配碱基的校正功能。使用Taq DNA聚合酶,反应中出现碱基的错配率为2.1x10^-4左右。

  三、 PCR热循环参数

  典型的PCR循环由变性、退火和延伸三步组成。变性是PCR的第一步,能否使模板彻底变性是启动和成功进行PCR的关键。通常,94℃ 30s足以满足各种DNA分子的完全变性。温度过高或高温持续时间过长会对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害。

  退火温度决定着PCR的扩增特异性。退火温度的选择,可以根据引物的长度和其G+C含量确定。引物长度介于15 ~25 bp时,可根据公式Tm=4(G+C)+2(A+T)来估算退火温度。在Tm允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。通常,退火时间设置为30 s,足以保证引物与模板DNA完全结合。

  延伸温度-般选择72℃,此时TaqDNA聚合酶活性最高,核苷酸的掺入率可以达到60~ 100核苷酸/秒。延伸时间取决于靶序列的长度。一般长度不超过1kb的靶片段,延伸1min足够;若超过1kb,则需适当延长延伸时间。

  温度时间参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上,20 ~25次循环后, PCR产物的积累即可达最大值。但实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100% ,因此通常选择20 ~30次循环比较合理(图2)。循环反应的次数越多,非特异性产物的量亦会相应增加。

PCR热循环参数

图2 PCR热循环参数

  四、PCR反应产物的积累规律

  在PCR反应中,DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。在反应初期,目的DNA片段呈指数式增加,随着目的DNA产物的逐渐积累,在引物-模板与DNA聚合酶达到一定比例时,酶的催化反应趋于饱和,此时目的DNA片段的增加减慢,进入相对稳定状态,即出现所谓的停滞效应或平台期。平台期的出现可能与下列因素有关:

  ①引物与dNTP消耗过多;
  ②长时间高温使TaqDNA聚合酶的活性下降;
  ③扩增终产物(焦磷酸盐和双链DNA)的抑制作用;
  ④非特异性产物与引物二聚体对反应物的竞争;
  ⑤高浓度产物使扩增产物解链不完全;
  ⑥当产物浓度高于10-8mol/L时,可能降低TaqDNA聚合酶的延伸和加工能力,或者出现引物的分支迁移物移位;
  ⑦酶与PCR产物结合后,游离浓度降低。

  到达平台期所需PCR循环次数取决于模板DNA的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性、非特异性产物的竞争等因素。

  大多数情况下,PCR反应中平台期的出现是不可避免的。但通常在出现平台期前,获得的靶DNA片段的数量已足以满足检测的需要。

  五、PCR技术特点

  法医学上应用PCR技术分析DNA多态性已经成为物证鉴定的主要手段。PCR技术具有以下几个特点:

  1.灵敏度高

  微量的模板DNA在PCR反应中以指数级迅速复制,理论上可以检测单个体细胞的基因组DNA.在微量或超微量生物学检材的分析问题上,PCR具有独特的优势。

  2.特异性高

  PCR引物序列是针对靶DNA片段的侧翼序列设计的,引物的特异性决定了扩增片段的特异性。

  3.适用于降解DNA检材

  PCR对模板DNA的完整性要求不高,检测的靶基因片段长度通常在2 kb 以下。陈旧、腐败检材中一般都保存小片段的靶DNA,多数能得到扩增产物,进行DNA分析。

  4.种属特异性好

  引物是依据人类基因组DNA序列设计合成的,只能与人基因组DNA发生退火,检材中污染的动物、植物、微生物DNA均不能扩增。

  5.操作简单,时间短

  耐热性DNA聚合酶的应用,使PCR的温度循环实现了自动化。

  PCR扩增产物中含有靶DNA片段的数十万甚至上百万拷贝,为后续的分析鉴定提供了足量的材料。以PCR为核心的衍生技术不断发展,建立了许多方便、快捷、实用的检测方法。

  PCR技术在物证鉴定中尚存在一些值得注意的问题。法医生物学检材是多样性的,保存条件亦各不相同,现场检材不可避免地会被PCR的抑制物污染,从而影响扩增反应效率,甚至使扩增失败。尽管已有不少的模板DNA纯化浓缩技术,但面对各种各样复杂的现场生物检材,如何选择适当的模板DNA提取和纯化方法,有效减少抑制物的影响,仍然是法医PCR分析中比较困难的问题。

  外源性DNA污染比较常见,动物DNA污染对PCR分析不会有大的影响,但人类DNA污染则后果严重。因为PCR灵敏度极高,即使数十或数百拷贝外源微量的人类DNA,也可出现假阳性扩增产物。实验室中的交叉污染,尤其是扩增产物的污染,是分析失败的主要人为因素之一,必须予以高度关注,因此应建立严格的实验程序及质量监测和质量保证体系。

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