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小卫星VNTR基因座分型技术及其局限性

来源:《DNA检验技术》  作者: 李民  日期:2020-08-11

  Amp-FLP技术早期是应用于小卫星VNTR基因座分型的。因为Taq DNA聚合酶的链延伸能力的限制,扩增片段长度多在2kb以下,故实际应用的基因座不多,有十余个。其中应用较多的有DIS80、ApoB、D17S30 等。

  目前应用的VNTR基因座的等位基因数只有10~30个,基因间长度差异十分规律,是重复单位的整倍数。PCR产物经电泳分离后,可依据片段长度确定等位基因和基因型。因此,通过群体调查可获得准确的离散型等位基因频率分布数据,可运用传统的统计遗传学理论对检测结论进行分析、评估。

  一、基本分型技术

  小卫星VNTR基因座分型技术比较简单,主要有模板DNA的提取与定量、PCR扩增、电泳分离、谱带显示、基因型判定等基本步骤。

  1、模板DNA的提取与定量

  模板DNA提取可采用有机溶剂提取法或Chelex-100提取法,其中有机溶剂法提取的DNA较纯,扩增效果较好。获得的模板DNA需按前述方法进行定量。

  2、PCR扩增

  PCR扩增可采用标准PCR体系,模板DNA用量50~100ng.常规PCR扩增体系可以完成小卫星VNTR基因座靶基因扩增,但基因片段长度在1 kb以下时,扩增效果较好。

  3、电泳分离和显带

  电泳分离采用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶( polyacrylamide gel, PAG)。小卫星VNTR基因座的基因长度为400 bp~1.2 kb,重复单位15 ~30 bp,2%浓度的琼脂糖凝胶可获得较好的分辨率。一般采用凝胶浓度5%和交联度3%(T5%,C3%)的PAG,凝胶缓冲液和槽缓冲液均为1×TBE.

  PCR扩增产物加同体积的载样缓冲液混匀后加样。载样缓冲液的主要成分有甘油或蔗糖以及染料溴酚蓝和二甲苯青FF.甘油或蔗糖可增加样本的比重,以便于加样;染料可作为监测DNA片段电泳迁移的指示剂,例如在5%的PAG中,二甲苯青FF染料带相当于260bpDNA片段的位置,溴酚蓝带相当于65bp.

基因分型系统

  电泳后的显带常采用银染法,也可以采用溴乙啶染色技术。

  (1)银染法是一种简单实用的技术。银染液中的Ag+可以与DNA形成稳定的复合物,在甲醛的作用下,Ag+被还原成银颗粒,DNA谱带呈黑褐色。常规PAG电泳分离后的凝胶直接染色显带分为以下4个基本步骤:

  ①电泳后PAG浸入10%的乙酸溶液中固定20 min,蒸馏水清洗。
  ②置0.1%的AgNO3水溶液中染色30min,蒸馏水清洗。
  ③显色液(3%的Na2CO3,0.05%的甲醛)中显带5~10min.
  ④至谱带清晰后,置10%的乙酸中停显,水漂洗。凝胶干燥后,分型结果可以长期保存。

  (2)溴乙啶染色。溴乙啶( ethidium bromide ,EB)是一种小分子荧光染料,可以嵌入双链DNA配对碱基之间,在紫外线激发下发出红色的荧光。它发出的荧光与DNA含量成正比。由于EB-DNA复合物中的荧光强度比溶液中游离的EB荧光大10倍左右,被染色的DNA电泳区带很容易鉴别。将电泳后的凝胶直接放入0.5μL/mL的溴乙啶溶液中染色30min后,在紫外线照射下观察并判定基因型别。也可以在凝胶中加入0.5 μL/mL 的溴乙锭,在电泳过程中随时监测DNA片段的泳动过程。

  前面已强调,溴乙啶是强诱变剂,并有中度毒性,操作中应加强自我保护。目前溴乙啶染色技术在Amp-FLP分型中已很少应用。

  4、基因型判定

  Amp-FLP分析VNTR基因座,等位基因按长度命名,有两种命名方式。一种是直接用片段长度bp命名。在加样电泳分离时,同时加DNA片段长度标准物(molecularmarker),显带后参照分子量标准确定靶基因的长度,命名等位基因。另一种方法是按照重复单位的重复次数命名。VNTR基因座等位基因间的实质差异是重复次数,按重复次数命名是目前的标准命名方法。命名参照的标准物是等位基因分型标准物( alelie ladder) ,由靶基因座所有的等位基因片段混合组成,每一个片段的重复次数是已知的。在同一电泳条件下,将等位基因与标准物比对即可确定等位基因和基因型。

  二、VNTR分型应用的局限性

  小卫星VNTR基因座的Amp-FLP分析在物证鉴定中曾广泛地得到应用,应用较多的基因座是D1S80、ApoB.但在实际应用中发现此类VNTR基因座存在一定的局限性,主要表现在:

  ①与STR相比,小卫星VNTR基因座的等位基因片段较大,不易扩增,故灵敏度相对较低。一般的模板用量需要20~100 ng.
  ②容易发生等位基因脱逸( allelie drop-out)。由于小卫星VNTR基因座不同等位基因间片段长度相差较大,扩增效率不一致,较小的等位基因优先扩增,从而导致较大的等位基因脱逸、漏检,将杂合子误判为纯合子。等位基因脱逸在模板量较少时更易发生。
  ③对已经腐败、降解的检材,小卫星VNTR分型的成功率不如STR基因座。轻度降解的模板DNA一般不影响小卫星VNTR基因座分型,但若DNA降解严重,则易造成分型失败或较大等位基因的漏检。

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