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提取基因组DNA的方法有哪些?(最全汇总)

来源:《真科检》  作者: 鉴定专家  日期:2020-08-27

  亲子鉴定中DNA提取方法分为三种:①手工提取;②半自动提取;③全自动提取。其中手工提取DNA方法是基础,半自动和全自动就是让机器设备来代替人工完成这些提取操作。下面我们来详细了解提取基因组dna的方法有哪些?

  一、手工提取DNA方法

  1、Chelex-100提取法(亲子鉴定手工常用方法)

  Chelex-100是一种苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的树脂,能够整合、吸附多价金属离子。检材中存在的金属离子能辅助核酸酶降解DNA,还会抑制PCR反应,因此加人Chelex-100来螯合金属离子,不仅能抑制了核酸酶活性,防止DNA降解,而且还降低金属离子对下一步PCR扩增的干扰。

  首先加水清洗样本,离心去除上清,除去血红素等杂质,然后加人5% Chelex-100悬浮液,加热、煮沸后细胞膜、核膜破裂,DNA释出在上清液中,即可进行下一步检验。

  优点:检材无需在多个试管间频繁转移,模板DNA损耗小,操作简单,耗时短,成本低廉。

  缺点:提取的DNA模板纯度低,扩增效果欠佳,不利于长期保存。

  2、有机提取法

  DNA分子位于细胞内,与组蛋白结合成核小体。首先在样本中加入去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K,裂解破坏细胞膜及核膜,消化与DNA结合的组蛋白,使DNA释放出来。然后在消化后的样本中加入有机溶剂酚一氯仿混合液, 蛋白质在有机溶剂存在的条件下变性沉淀,而DNA易溶于水。

  离心后,相对密度较大的有机溶剂在下层水中,DNA在上层水中,蛋白质沉淀在中间。最后吸取上层DNA水溶液,加人乙醇,DNA在大量乙醇及单价阳离子存在的条件下沉淀析出,通过离心即可回收。

  最后一步也可以用超滤管(如mirocon-100)离心DNA水溶液,小分子的水被过滤,大分子的DNA留在滤管中,达到浓缩回收的目的。

  优点:作为最早使用的DNA提取方法,有机提取法能获得较高质量的大片段双链DNA,样本中的非DNA物质(尤其是蛋白质)去除得比较彻底,有利于DNA模板的成功扩增及长期保存,比Chelex-100提取方法能更彻底地纯化DNA.

  缺点:操作步骤复杂,耗时耗力,需要多次添加试剂,多次转移样本,增加了污染及误操作的风险。有机溶剂对人体有害,且容易挥发,不易防护。

DNA手工提取

  3、无机提取法

  利用6 mol/L NaCl 或醋酸钠沉淀蛋白质代替有机酚-氯仿抽提步骤去除蛋白质,其他过程同有机溶剂提取法。

  4、差异裂解提取法

  根据精子细胞与上皮细胞的结构差异设计,常用于性犯罪案件中男女混合生物检材的检验。因精子细胞膜及核膜富含二硫键,对SDS及蛋白酶K有较强抵抗作用,而DTT等巯基试剂可使其裂解。上皮细胞没有这一特性。首先在样本中加人蛋白酶K和SDS,裂解上皮细胞的细胞膜及核膜,释放非精子细胞DNA,离心沉淀洗涤后仅留有精子。然后在沉淀中加人蛋白酶K及DTT,裂解精子膜,释放精子DNA,用于下一步分析。

  缺点:女性成分太多时会难以完全去除。有些男性精液中精子细胞过少( 如输精管结扎术后),无法通过此法分离单独的男性成分。含混有多个男性精液的样本也无法用此法分离出单独男性个体成分。

  5、碱裂解法

  NaOH之类的强碱能使蛋白质变性,破坏细胞膜、核膜及核酸酶,释放出DNA,但不破坏DNA一级结构。

  6、磁珠提取法(半自动实现原理)

  利用磁性硅胶吸附白细胞,用细胞裂解液裂解细胞,从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面,蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下,磁性颗粒与液体分开,回收颗粒,再用纯水或TE洗脱吸附的DNA.

  7、硅珠提取法(全自动实现原理)

  在一定条件下,二氧化硅(SiO2) 能可逆性地吸附DNA.采用本方法时,首先在样本中加入蛋白变性剂(异)硫氰酸胍(GuSCN), 不仅能破坏细胞膜及核膜上的蛋白,释放出DNA,而且还能使核酸酶失活,防止核酸酶降解DNA.然后在样本中加入硅珠颗粒吸附DNA,通过洗涤除去蛋白质和其他组织成分,仅留下吸附有DNA的硅珠。最后加入洗脱液,56℃孵化,使DNA与硅珠解离,释放于洗脱液中。

  硅珠法提取操作如下:

  第一步:涡旋振荡液体样品/制备好的裂解液/树脂,室温保温5分钟;
  第二步:短暂涡旋振荡商心管使树脂悬浮,将离心管放在磁架上,小心去除溶液,不要触碰树脂;
  第三步:用制备的裂解液洗涤一次,短暂涡旋振荡离心管使树脂悬浮;
  第四步:用洗涤液洗涤3次,每次短暂涡旋振荡离心管使树脂悬浮;
  第五步:打开离心管盖子,在室温下空气干燥5分钟;
  第六步:加入洗脱液,董好盖子, 65℃加热5分钟;
  第七步:从加热器上取下离心管,立即涡旋振荡离心管,使树脂悬浮后将离心管放回磁架上;
  第八步:小心将DNA溶液吸出放在所选的容器内

  优点:去除扩增抑制物的效果好。

  缺点:洗涤步骤较多,存在模板损耗、污染及误操作的风险。

  8、免提取的直接扩增法

  直接扩增法是将未经提取、纯化处理的检材直接加入扩增反应混合液进行PCR扩增。检材中常含有一些PCR抑制剂,如染料、血红蛋白、腐殖酸等,会使PCR扩增效率下降或失败。扩增试剂经改进后,检材无需提取,在常见抑制剂存在的条件下仍能扩增出比较理想的结果。

  优点:缩短检验时间,简化实验步骤,提高工作效率,降低提取中污染及误操作的风险,也避免了在洗涤、转移过程中DNA模板量的损耗。

  缺点:污染严重或载体体积过大、细胞较分散的检材还是需要经过纯化、浓缩的前处理,不适合直接扩增。

  二、半自动提取DNA方法

  通常使用半自动提取仪,本文以南京微略MW-AP48核酸纯化仪为例。将处理好的检材移入核酸提取仪配套预封装试剂96孔深孔板中的样本孔,打开仪器舱门,放入96深孔板和搅拌套,关闭舱门后启动提取仪,提取仪首先可以对样本加热升温进行细胞裂解,然后由磁棒和搅拌套来吸附磁珠并移至样本孔,待磁珠上吸附了裂解释放的核酸后,再通过磁棒和搅拌套将磁珠转移至清洗孔。

  核酸提取制备的整体步骤:

  第一步:放入样本;
  第二步:裂解磁珠结合洗涤洗脱;
  第三步:将磁珠移入洗脱孔中进行洗脱;
  第四步:洗脱完毕后移走磁珠;
  第五步:纯化DNA.

  之后,将提取好的DNA加入到96孔板对应孔中,再添加检测试剂,使用封膜机将96孔板封上,然后放置到扩增仪上进行扩增,扩增完成后经传递窗口将样本传递至测序室。测序室将扩增产物加入相应的试剂耗材中,使用测序仪上样电泳,待测序完毕后导出检测图谱,进行图谱分析,就可以获得被鉴定者的DNA信息。

  三、全自动提取DNA方法

  使用仪器自动化提取DNA能够将检验人员从繁重重复的实验操作中解放出来,同时,标准化的提取程序也减少了人工操作的不可避免的误差。尤其在群体性灾难处理或大规模犯罪嫌疑人数据库建设中,需要快速、及时处理大量的检材,自动化提取的优势就更加明显。

全自动提取仪

  目前,市场上商品化的自动化提取仪多基于二氧化硅提取法原理设计,取样放入仪器后,加人裂解液裂解、硅珠吸附、洗涤除杂质及洗脱回收DNA全程均自动完成。如QIGEN EZ1 DNA自动化工作平台(QIANGEN公司),Maxwell 16自动纯化仪(Promega公司),AutoMate Express法医DNA提取系统(AB 公司),能在几十分钟内一次提取10多份样本。而Tech Freedom EVO自动化液态处理工作站(Tecan 公司)甚至能在2.5小时内一次处理96个样本。

  自动化提取适用于比较均一的样本,如采集被鉴定人的血FTA卡,因为均一样本无需按照各个样本情况逐个调整实验方案,适用标准化流程提取。

  Maxwell 16自动纯化仪及工作流程:

  第一步:基于二氧化硅法原理设计,仪器预置有提取纯化的程序;
  第二步:条形试剂盒小管内预先装有各步骤所需试剂,撕掉条形盒上方的封条即可使用。样本加人试管1内(如下图:1.裂解液; 2.磁珠颗粒; 3.裂解液; 4.洗涤液; 5.洗涤液; 6.洗涤液; 7.8.留空);

试剂盒

  第三步:将所有加好样本的条形试剂盒放到制备架上(最多可放16个,即最多可一次提取16个样本)。放上对应的洗脱液小试管,并根据需要加入30~ 100 μl的洗脱液;
  第四步:将制备架放人仪器中,即可按预设的程序进行裂解、吸附、洗涤、洗脱等步骤,50分钟内即可自动提取好16份样本。

  DNA提取是亲子鉴定的第一步。DNA位于细胞内,直接提取到的人体样本如血痕、口腔拭子、毛发等,含有大量血红素、脂肪、蛋白、钙等可能影响DNA分析的成分,也需要把DNA从这些人体组织成分中分离。DNA提取的目的是去除检材中的非DNA成分,同时尽可能保留完整的DNA一级结构,以供进一步分析。

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